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1、实验1水果中维生素C的测定——2,4•二硝基苯腓比色法（GB/T5009.86-2003）一、实验目的1.学习及了解2,4■二硝基苯联比色法测定总抗坏血酸的原理及操作耍点。2.了解可见■紫外分光光度计的工作原理，学会使用可见■紫外分光光度计。3.能够熟练绘制标准Illi线。二、原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2,4■二硝基苯月井作用牛成红色月杀，根据月杀在硫酸溶液中的含量与抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。三、试剂水为蒸锚水，试剂均为分
2、析纯。3.14.5mol/L硫酸：谨慎地加250mL硫酸（相对密度1.84）于700mL水中,冷却后用水稀释至lOOOmLo3.285%硫酸：谨慎地加900mL硫酸（相对密度1.84）于100mL水中。3.32,4-二硝基苯腓溶液（20gZL）:溶解2g2,4•二硝基苯胖于100mL4.5mol/L硫酸中,过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。3.4草酸溶液（20g/L）:溶解20g草酸（H2C2O4）于700mL水中，稀释至lOOOmLo3.5草酸溶液（10g/L）:取500mL草酸溶液（20g/
3、L）稀释至lOOOmLo3.6硫腺溶液（10g/L）：溶解5g硫于500mL草酸溶液（10g/L）中。3.7硫腺溶液（20g/L）:溶解10g硫麻于500mL草酸溶液（10g/L）中。3.8lmol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中,并稀释至1200mLo3.9抗坏血酸标准溶液：称取lOOOmg抗坏血酸溶解于100mL草酸溶液（10g/L）小，此溶液每毫升相当于10mg抗坏血酸。3.10活性炭：将100g活性炭加到750mLlmol/L盐酸中，回流lh〜2h,过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe”
4、）为止，然后迸于110°C烘箱屮，烘干。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氧化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。四、仪器4.1恒温箱:37°C±0.5°Co4.2可见■紫外分光光度计。4.3捣碎机。五、实验材料六、实验步骤6.1试样的制备（全部实验过程应避光。）6.1.1鲜样的制备：称収200g鲜样及吸1R200mL20g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，每小组准确称取约40g（含lmg〜2mg抗坏血酸），倒入lOOmL容量瓶屮，川10g/L草酸溶液稀
5、释至刻度，混匀。6.1.2干样制备：称lg〜4g干样（含lmg〜2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入10g/L草酸溶液磨成匀浆，倒入lOOmL容量瓶内，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。6.1.3将制备的鲜样、干样过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，倾出上清液，过滤，备用。6.2氧化处理取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇lmin,过滤，弃去最初数滝升滤液。取10mL此氧化提取液,加入10mL20g/L硫脉溶液，混匀，此试样为稀释液。6.3呈色反应6.3.1于三个试管中各加入4mL稀释液
6、（6.2）。一个试管作为空白，在其余试管中加入l.OmL20g/L2,4•二硝基苯脐溶液，将所有试管放入37°C±0.5°CtH温箱或水浴屮，保温3ho6.3.23h后取出，除空口管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL20g/L2,4■二硝基苯耕溶液，在室温中放置lOmin〜15min后放入冰水内。其余步骤同试样。6.485%硫酸处理当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要lmin,需边加边摇动试管。将试管白冰水中取出，在室温放置30min后
7、比色。6.5比色用lcm比色杯，以空口液调零点，于500nm波长测吸光值。6.6标准曲线的绘制6.6.1加2g活性炭于5OmL标准溶液中，振动lmin,过滤。6.6.2取20mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫腺，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度200pg/mLo6.6.3取5,10,20,30,40,50,60mL稀释液,分别放入7个lOOmL容量瓶中,用10g/L硫腺溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为10、20、40、60、80、100、120
8、ig/mL。6.6
9、.4按试样测定步骤形成月杀并比色。6.6.5以吸光值为纵坐标，抗坏血酸浓度（g/mL）为横坐标绘制标准曲线。七、六、结果计算工Fx塑m1000式中：X——■试样中总抗坏血酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；C——山标准曲线查得或山回归方程算得“试样氧化液”中总抗坏血酸的浓度，单位为微克每亳升（pg/mL）；V——试样用10g/L草酸溶液定容的体积，单位为毫升（mL）；F——试样氧化处理过程中的稀释倍数；M试样的质量，单位为克（g）«
