仪分实验高效液相色谱讲义-13级

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1、高效液相色谱实验报告要求1、预习报告与实验报告为i份即可。实验中会检查预习报告。实验报告包括：目的、原理、仪器与试剂、实验内容、数据处理、结果与讨论、思考题七个部分（建议在预习报告中就把需要的表格打印好，方便记录数据）2、两部分实验的实验报告建议合写成一份，即写成一整个实验的实验报告，不要写成两个实验的实验报告，因此盂要两部分实验的目的、原理、仪器与试剂、实验内容、数据处理、结果与讨论、思考题等七个部分整合一下。3、原理与步骤不要照抄实验讲义，简单明了即可，其目的是保证自己看着预习报告就知道该如何乂快乂好的做好这个实验。而实验结束后建议检查一下自己的报告步骤等等，要与实验真实

2、情况相符合。4、经助教签字的原始数据记录须附在实验报告内。数据处理中要求每个人拿一组数据为例，写出计算过程。两人一组的同学须选择不同的数据写计算过程。5、报告只要手写版，电子版与打印版均不接收。请尽量统一用实验报告纸來写，单面使用10张以内，实验报告过长会被扌II分，简明扼要即可。4.2高效液相色谱法4.2.1原理高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）,又称高压液相色谱（HPLC）＞高速液相色谱（HSLC）或高分辨液相色谱（HRLC）,是20世纪60年代末在经典LC慕础上发展起來的现代色谱分析方法。其分离原理是：流动相

3、在高压输液泵的驱动下流过色谱柱，样品随流动相经过色谱柱时，山于不同的样品组分与固定相及流动和的作用力不同，从而得到分离。实际上HPLC与经典层析（如薄层色谱）没有木质的区别，但山于HPLC采用了高压泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器，故在分析速度、分离效率、检测灵敏度和操作自动化方而，都达到了可与气相色谱相比的程度，并保持了样品适用范围广、流动相种类多和便于制备的柱层析优点，在牛•物工程、制药工业、食品工业、环境监测和石油化工等领域获得了广泛的应用。特别是在当今迅速发展的生命科学和材料科学领域，HPLC已经成为必不可少的分析手段。HPLC的分类方法有多种。按照分离机理可分为吸

4、附色谱、分配色谱、体积排阻色谱、离子交换色谱，以及亲和色谱。按照色谱柱洗脱动力学可分为洗脱色谱、前沿色谱和置换色谱。按照分离目的则可分为分析液相色谱和制备液和色谱。按照流动相和固定和的和対极性乂可分为正和色谱和反相色谱。实际工作中85%左右的应用为反相HPLC。还可以按照色谱柱的尺寸分为常规HPLC（色谱柱内径2.1・4.6mm）和毛细管HPLC（色谱柱内径l・2mm）。近年来，采用亚微米粒度填料的细内径（SImm）色谱柱越来越多，被称为超高效或超高压液相色谱（ultraperfonnanceliquidchromatography,UPLC）。图4.4HPLC仪器组成示意图

5、1-储液瓶（输液管入口端安装有过滤器）；2-高压输液泵；3•混合器和阻尼器;4■进样器（阀）；5■色谱柱;&检测器;7-废液瓶；8-数据处理和控制系统4.2.2仪器结构与操作1液相色谱仪的构成液相色谱仪器按照用途可以分为制备型和分析型两大类。前者用于纯物质的制备，一般采用大流量的泵和大容量的色谱柱;后者又可按照流量大小分为常规HPLC.毛细管HPLC、纳流HPLC等类型。虽然目前市场上的HPLC仪器型号繁多，性能各杲，但总的来说，仪器的慕本结构是相似的。图4.4所示为一台普通分析型HPLC仪器的原理示意图，主要由下面儿部分组成：（1）由溶剂（流动相）输送系统。主耍包括储液瓶、

6、过滤头、高压输液泵和连接管线，其功能是将流动相输送到色谱仪屮。根据流量大小不同，高压输液泵有制备泵、分析泵、以及微量或纳流泵。分析用的高压输液泵流速范围为0.01-10mL/min,耐压吋达40MPa或更高。（2）进样系统。般釆用六通进样阀，其功能是将样品引入仪器系统中。（3）柱系统。这是实现分离的心赃，多采用不锈钢材料和聚醴讎酮（PEEK）材料，内径为1.0-4.6mm,长度5-25emo根据分离模式不同，采用不同的填料。比如最常用的反相色谱填料为十八烷基键合硅胶填料。（4）检测系统。HPLC采用检测器冇紫外■可见光吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器、示差折光检测器、质谱

7、检测器等。（5）数据处理和控制系统。HPLC的分析流程与GC®本相同。无论何种HPLC分离模式，具仪器纽成也是类似的。储液瓶和泵之间-•般川聚四氟乙烯管连接，而从泵到检测器则需耍采用细内径（0」7mm左右）的不锈钢管连接。因为HPLC的色谱柱长度（5-30cm）远比GC毛细管柱短，柱外效应的影响更为严重，所以HPLC的连接管线不但要内径小，而且要尽可能的短。2液相色谱仪的操作本实验采用岛津LC-20A型高效液相色谱仪，主要由两台双柱塞往复式循环泵、紫外检测器、色谱工作站和7725i空六通进样阀组成。HP