第二讲 正常和肿瘤组织细胞的培养(2009.10)

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1、正常和肿瘤组织细胞培养BinLuAttardiInstituteofMitochondrialBiomedicine内容正常组织细胞培养上皮细胞的体外培养血管内皮细胞的体外培养肾小管上皮细胞的培养巨噬细胞的培养淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。上皮细胞的体外培养许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功能；上皮组织还常发生肿瘤。上皮细胞的基本特征：1.上皮组织的形态结构群体依赖性（p

2、opulationdependence)接触抑制（contactinhibition)2.上皮细胞的极性贴壁依赖性细胞-贴壁生长生长基质3.上皮细胞间的连接体外培养的上皮组织细胞的生长生物学1.形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显2.体外培养上皮组织的生长与增殖特征(1)体外培养的特殊条件：防范微生物污染生长基质的支持特殊的培养基M199RPMI1640DMEMFamF12无血清培养基去成纤维细胞根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。

3、要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。防范微生物污染皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。生长基质的支持M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作

4、用并不明显。DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。特殊的培养基去除成纤维细胞上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上

5、皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。(2)体外培养上皮细胞的形态学变化体外培养上皮组织细胞的观察与检测1.一般形态学观察光镜：形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清电镜：桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液pH变化：颜色变化？培养物的污染情况：透明度变化？2.组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白血管内皮细胞的体外培

6、养人脐静脉内皮细胞的培养组织来源：婴儿脐带培养用液：M199+20%FCSD-Hanks0.1%胶原酶溶液1.主要材料：2.培养方法：分离细胞培养法1).将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2).用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。3).用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。4).消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌

7、的PBS溶液冲洗脐带2-3次。5).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。(1)关于接种材料的制备取材与消化消化酶、浓度、时间(2)排除成纤维细胞传代去除法加肝素培养法(90u/ml)刮除法(3)关于培养液(4)关于传代培养5.讨论：(1)光镜检查(2)透射电镜检查：W-P小体(3)VIII因子相关抗原的免疫组化检测6.内皮细胞的鉴定：肾小管上皮细胞的培养1.主要材料：a.细胞来源：b.无血清培养液：基础培养液：DMEM/HamF1

8、2(1:1)添加物：胰岛素5g/ml转铁蛋白5g/ml硒5g/ml氢化可的松36ng/mlT34ng/mlEGF10g/mlc.消化液：0.2