组织细胞的三维培养

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1、组织细胞的三维培养学生：张旭朗导师：马小军研究员2005－5－18SeminarⅡ概念三维培养的构成三维培养的特点三维培养的方法研究方法三维培养的应用展望一、三维培养的概念相对于单层细胞的二维培养而言，利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，形成类似体内组织的结构，发挥其功能二、三维培养的构成1、辅助物：人工软骨[1]、PET聚乙烯酯[2]、纤维蛋白支架[3]、胶原支架[4-5]、旋转生物反应器[6]、微胶囊[7]、中空纤维[8]2、细胞：原代组织细胞－大鼠肝、软骨、脂肪[9]、成骨样细胞、干细胞[10]、肿瘤细胞[1

2、1]三、三维培养的特点1、生长特点：三维结构、异质性、生长速率及氧气、葡萄糖等梯度分布2、组织学特点：细胞分三层（直径>300µm）可有类似组织基质的物质产生3、生长动力学：三维培养细胞以G1/G0期细胞占优势，S期细胞较少四、三维培养的方法1、旋转式培养：旋转细胞培养系统或培养瓶，旋转生物反应器同时产生较多量直径为1－2mm的细胞球2、非黏附物包被的培养瓶或培养皿：琼脂、琼脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯3、支架五、研究方法1、细胞生长及形态：体积－直径免疫组化（BrdU、PCNA、Ki-67）流式细胞仪（DNAHoechst33

3、342、PI）电镜2、细胞球的生理特性：微电极（pO2orpH）NMR(脂代谢)生物体发光技术（ATP、Lactate、glucose）六、三维培养的应用1、实验性治疗⑴放射效应[12]：分化程度影响放疗效果⑵药物耐受[13]：培养方式是决定耐药的因素之一⑶免疫疗法[14]：肿瘤细胞与免疫细胞作用2、代谢及代谢环境研究三维培养的细胞可模拟肿瘤生成中的无血管阶段、微转移灶或毛细血管之间的微区域模拟在体细胞的环境：⑴良好生长环境⑵缺氧、缺乏营养、废物积聚或pH降低等协同作用－－－“toxicenviroment”[15]3、细胞

4、的生物学特性⑴浸润和转移：肿瘤细胞和基质共培养（E-cadherin、ICAM-1）[16,17]⑵细胞黏附：研究细胞聚集过程中黏附因子的作用[18]⑶血管形成：VEGF（血管内皮生长因子）在恶性肿瘤血管形成中起主要作用[19]4、实验性组织模型移植物以组织或器官的方式培养，使其在一定时间内保持原有功能简单的讲：使细胞自发或借助人工基质聚集并诱导细胞分化、维持细胞功能举例：人工肝（肝细胞、纤维细胞等与明胶海绵、琼脂、胶原共培养）[20-22]5、胚体干细胞与拟胚体⑴胚胎发育到囊胚期，此时细胞分化为两大类，即位于周边的滋养层细

5、胞和位于腔内但居于一端的内细胞团（innercellmassICM）。只有ICM将来发育成胚胎本身，把ICM从胚胎中分离出来在一定条件下培养，可形成具有无限增殖能力的细胞群，称为胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）⑵当ES细胞经过2天悬滴培养、2天悬浮培养后，可形成简单拟胚体（3－D），拟胚体内包含着来源于三个胚层的不同细胞微囊化肿瘤细胞用于药筛1、抗肿瘤药物筛选的研究现状⑴多采用体外单层培养的肿瘤细胞：简单、易操作、费用低、可大量应用、生长方式及环境与在体肿瘤差距较大⑵动物实验：费用高、生存条件苛刻

6、、生长方式及环境与在体相似⑶手术切除标本：回顾性研究、不能动态观察⑷体外三维培养：模拟肿瘤生长方式及环境、可大量应用、费用较低，如MCTS肿瘤细胞在体与体外三维生长示意图2、微囊化细胞三维共培养特点⑴微胶囊为半透膜⑵细胞呈三维立体生长⑶生长空间可控⑷空间相对封闭⑸“被动”共培养⑹实质与间质细胞共培养-模拟体内3、微囊化肿瘤细胞的三维培养⑴材料：海藻酸钠，聚赖氨酸，人乳腺癌细胞系MCF-7⑵方法：静电液滴法Day7Day0Day5Day24、药物对三维生长细胞的抑制⑴药物：丝裂霉素（MC）、阿霉素（ADM）、5－氟尿嘧啶（5－

7、FU）⑵浓度和作用时间：0.1ppc,1ppc及10ppcPeakplasmaconcentration(ppc),thehighestlevelofdrugthatcanbeobtainedinthebloodusuallyfollowingmultipledoses,ofADM,MCand5-FUwas0.4g/mL,3.0g/mLand10g/mL,respectively.分别作用24h,48h,72hbgafhcejid***a***b***a***b**七、展望胚胎干细胞的应用研究及胚胎发育致癌机制的研究r

8、eference1.DarlingEM,AthanasiouKA.RetainingZonalChondrocytePhenotypebyMeansofNovelGrowthEnvironments.TissueEng.2005March/April;11(3-4):395-403.2.X