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1、研究方法讲座作业13级的物分析学陈仲辉130420222文献来源：Yuan,L.;Lin,W.;Xie,Y.;Chen,B.;Zhu,S.,SingleFluorescentProbeRespondstoH2O2,NO,andH2O2/NOwithThreeDifferentSetsofFluorescenceSignals.JournaloftheAmericanChemicalSociety2011,134（2）,1305-1315.对H2O2、NO和H2O2/NO有三种不同荧光响应的单分子荧光探针一、丈献
2、內彖综述H2O2和NO都与诸多生理过程有关。该文献设计、合成了一种探针FP-H2O2-NO,并研究了英物理性质，利用其在细胞内成像。这是第一种可以对h2o2>no和H2O2/NO产生三种不同荧光信号的单分子荧光探针，实现高通量检测。活性氧粒子（ROS）和活性氮粒子（RNS）是与许多生理学过程密切相关的两类粒子。而其中氏。2和NO则是两种重要的ROS或RNSo两种分子在细胞中达成一种微妙的平衡，可以抵抗病原体，并与许多疾病有关。Z前已有一些课题组报道应用电子自旋共振（ESR）的方法检测生物体内ROS和NO。但是这
3、种方法不能用于活体生物环境。因此荧光检测成为本论文的创新点。但是之前报道的荧光探针只能单独检测H2O2或NO,如果用混合探针则可能引发荧光信号的干扰。因此，该课题组合成的单分子荧光探针FP・H2O2・NO基于7■疑基香豆索.罗丹明体系，可以对H2O2、NO和H2O2/NO由不同的荧光响应，具有重要意义。、卖验过程及相关结果分析1、探针FE7QTC以及对照化合物FEFQ、勺设计与合成探针FP-H2O2-NO（文献中的figure1.）的设计主耍基于以卜•几点考虑：（1）荧光染料的选择。荧光染料选用了7■轻基香豆素
4、和罗丹明。7■疑基香豆素和罗丹明染料的吸收分别在400和550nm左右。因此，它们的吸收波K相互分开，可以被单独激发。此外，7■轻基香豆素和罗丹明染料的发光分别在460和580nmo也就是说它们的发光可以互相分开，在发光光谱上不会交迭。这使得它们可以在光学显微镜卜•同时被观测到，这也是可以对H2O2和NO双色成像的关键。（2）两种荧光染料的连接。7■轻基香豆素和罗丹明染料通过一个刚性的哌嗪基团连接。刚性的连接基团确保了7■轻基香豆素■罗丹明骨架可以高效地发生共振能量迁移过程。这一点使得多重荧光信号成为了可能。（
5、3）H2O2和NO的响应位点的选择。该文献选择了两种生物相容性、化学特异性的基团分别用于检测H2O2（硼酸酯）和NO（苯二胺）。（4）确定选择基团的位置。为了将两种基团的相互作用降到最低，应将两个集团放在分子骨架的两端。（5）合成路线。（6）7■轻基香豆素■罗丹明框架设计策略的可调节性。灵活的设计使得框架具有各种不同可能的反应位点。2EEFQTO光谱性质作者首先用对照化合物FP-H2O2和FP-NO检测了硼酸酯反应位点和苯二胺位点对H2O2和NO的选择性。如figure2a所示，FP-H2O2对H2O2冇较强的
6、荧光发光相应，然而其对NO没有荧光响应，这说明硼酸酯位点相对NO来说，对H2O2有较高的选择性。如figure2b所示，FP-NO的苯二胺位点相对H2O2来说,也对NO冇较高的选择性。综上所述，硼酸酯和苯二胺位点可分别独立地对H2O2和NO作出荧光响应，这对探针FP-H2O2-NO是至关重要的。在含有20%的pH为7.4的PBS缓冲液中用NO或H2O2滴定FP-H2O2-NO(1
7、iM)o如figure4a所示，随着H2O2浓度的增加,400nm光激发下，460nm处荧光强度也随之增长。然而用400(figur
8、e4a)或550(figure4b)nm光激发，在581nm处都没冇发光。也就是说，在出。2存在的条件下，FP-H2O2-NO的发光信号模式为：蓝■黑■黑。在NO存在的条件下，用550nm光激发时，在581nm处发生明显的荧光发光现彖(figure4d)0然而用400nm光激发，则在460或581nm处都没有发光(figure4c)。也就是说，在NO存在的条件下，FP-H2O2-NO的发光信号模式为：黑■黑■红。以上结果说明硼酸酯和苯二胺反应微点可以选择性对H2O2和NO响应。发光波长较大的差距(121nm)使
9、得这一探针可以用于H2O2和NO的级联双色成像。探针与H2O2和NO的速率常数分别为3.02X10'3s'1和1.18xio"J(准一级反应速率常数)。随后作者研究了FP-H2O2-NO对H2O2和NO共同存在时的荧光响应信号。结论是H2O2和NO共同存在的条件下，FP-H2O2-NO最终的荧光信号模式为黑・红■红。HeLa细胞中HQ和心勺荧光成像37°C下，HeLa细胞在FP-H2
