专家解答体内荧光成像技术难点

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1、专家解答体内荧光成像技术难点1.如何解决组织吸收问题来自斯坦福大学放射学系助理教授JianghongRao领导的研究小组在进行“Examiningproteaseinvolvementintumormetastasisandcellmigration”（肿瘤转移与细胞迁移过程中涉及的蛋白酶）这一项研究中遇到了一个难题：利用标准的荧光分子标记观测深部组织，激发荧光的光源必须能穿透具有强吸收力和光散射的组织，并且当标记分子发出光时，也要能通过同样的组织块，从而被检测到。为了解决这个难题，研究人员采用了一种称为生物发光共振能量转移（BioluminescenceResonanceEn

2、ergyTransfer，BRET）的方法进行组织成像。不同于利用生物体外激发光源的能量转移方法，BRET主要依赖于生物发光的荧光素酶来提供荧光标记需要的能量转移。一般而言，进行BRET实验的研究人员是将与荧光素酶与荧光蛋白相交联，后者会吸收生物荧光，并重新发出光，但是由于这些BRET交联物的光仍然有大部分会被吸收和散射掉，因此剩下的信号依然很弱。Rao改进了这一方法，他将荧光素酶交联在quantumdots(QDs)，而不是荧光蛋白上，这就将发出的光线变成了依然是长波长，但吸收和散射不强的光。为了能对深部组织进行成像，Rao等人又将luciferase-QD这个结构连接上了一

3、个配体——这个配体与目的分子相连。这样当将底物，复合体（包括荧光素酶的荧光基团）注入小鼠的尾静脉的时候，BRET标记就能发出两种特殊的光：蓝色的生物荧光和红色的quantum-dot光，这样就能更清楚的观测组织。这里Rao用于解决组织吸收问题的是一类新型的荧光探针，即量子点Qdot或称为半导体纳米晶体，所谓Qdot，指的是准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100纳米(nm)以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantumconfinement

4、effect)特别显著。这种纳米材料对于体内光学成像来说有着得天独厚的光学特点，这就是吸收性高、量子产量高、发射谱带窄、斯托克司频移大以及光褪色抗性强等，能够发射不同波长光谱，可以为单一波长所激发，适用于在一个实验中检测多靶点，因此非常适合活细胞成像和动态研究，甚至有人认为这种纳米荧光是纳米技术的真正代表，给荧光技术带来革命性的突破。其具体特点如下：·QDs的发射谱单一而且很“窄”。其半峰宽（FWHM）大都在40nm以下，更好的可以达到30nm甚至十几个nm，因此，QDs作为探针，可以很方便的区别于背景信号或者其它探针的信号。·QDs的激发谱很宽，可以在低于发射谱的广泛区间内任

5、意选择激发波长。这个属性使得对设备（光源）的选择变得更加方便，而不必受限于特殊激光器。QDs的这个特点还可以让我们在同一固定激发波长下，同时激发不同颜色的QDs，从而使需要实时观测多种目标分子运动或反应的实验变得从容不迫和得心应手。·QDs的发光强度高。与常用的有机小分子染料相比，QDs的发光强度要高几倍乃至几十倍。这一方面取决于QDs的荧光量子效率，另外也决定于QDs的摩尔消光系数。毋庸置疑，高发光强度能够更为方便地从复杂背景中（如自发荧光）提取需要的信号。·QDs的稳定性很好。虽然早期的QDs在光学/化学稳定性上不存在非常突出的优势，但近年来技术的改进是QDs的稳定性大幅提

6、高，在生理条件下可以保持几个月而没有明显的衰减。·QDs表面经过化学修饰，可以携带氨基、羧基、巯基等，可以方便地与选择的生物分子缀合，而不必再为构建探针的策略而惮心竭虑，而这几种化学反应的效率，已经可以足够满足构建探针的要求。·超高的表面积-体积比允许QDs表面存在丰富的化学基团，为选择构建多功能探针提供了优秀的平台，比如，构建同时具有细胞/组织靶向性、跨膜属性、核定位属性以及治疗特性的QDs生物探针。目前市面上此类染料并不是十分常见，经典的纳米荧光染料主要来自同名注册的公司：QuantumDot公司，这家公司注册于1998年，创办者是麻省理工学院的MoungiBawendi和

7、加利福尼亚大学的Paul，这家公司由此在财政上获得3，750万美元的利润，《财富》还将这一项技术列为2003年具有突破性的尖端技术之一。目前这家公司已被Invitrogen以八位数的金额收购了（Invitrogen现在也改名了，合并ABI后将改名为生命技术公司）。Qdot是QuantumDot公司革命性的纳米荧光染料，制作过程是将镉和硒一起放在溶液中加热，形成半导体晶体。轻微的改变过程可形成不同大小和组成的晶体，因此他们将发出不同的光。将锌和硫加入混合物，在每一个晶体上形成一个壳，然后晶体包