抗李斯特菌溶血素单克隆抗体制备及初步鉴定

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1、抗李斯特菌溶血素单克隆抗体制备及初步鉴定作者：董慧，焦新安，殷月兰，潘志明，黄金林【摘要】目的：研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb)。方法：通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX6p1hly),以SDSPAGE分离菌体蛋白，切割目的蛋白LLOGST条带，研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。利用亲和层析法纯化目的蛋白，作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定腹水效价，DotELISA、Westernblot分析mAb的特异性。结果：获得3株稳定分泌抗LLOmAb的杂交瘤细胞株3B6、4D1、5D10,其Ig亚

2、类均为IgGlo3B6.4D1、5D10腹水的ELISA效价分别为1：2X105、1:2X105、1:1X105oWesternblot试验中，3株mAb均能与融合蛋白LLOGST发生反应出现特异性条带，而与纯化蛋白GST不反应。在DotELISA试验中，3株mAb均能与表达LLO的细菌发生特异性反应。结果表明，mAb3B6、4D1、5D10是针对LL0的特异性mAb。结论：成功地制备了抗LL0的mAb,为进一步研究LL0的生物学特性、产单核细胞李斯特菌的致病机制，以及建立产单核细胞李斯特菌(LM)快速检测技术奠定了基础。【关键词】李斯特菌溶血素产单核细胞李斯特菌单克隆抗

3、体[Abstract]AIM：Topreparethemonoclonalantibodies(mAbs)againstlisteriolysin0(LLO),whichisthemajorviruleneefactorofListeriamonocytogenes.METHODS：TheBALB/cmicewereimmunizedwiththeSDSPAGEproductofBL21(pGEX6p1hly).ThepurifiedLLOGSTproteinwasusedasantigenfordetection.mAbsagainstLLOwerepreparedby

4、usingthelymphocytehybridomatechnique・ThespecificityofELISAandWesternblot,linesnamed3B6,4D1andLLOwereobtained.ThethemAbswereIgG1.ThemAbswascharacterizedbyDotRESULTS：Threehybridomacell5D10secretingmAbsagainstimmunoglobulinsubclassesofELISAtiteroftheasciticfluidsof3B6,4D1and5D10was1：200000,1

5、：200000and1:100000,respectively.WesternblotanalysisconfirmedthethreemAbsreactedonfusionproteinLLOGSTbutdidn"treactonproteinGST.DotELISAprovedthethreemAbsonlyreactonthebacteriaexpressingLLO.CONCLUSION：ThesuccessfulpreparationofthreemAbsspecifictoproteinLLOlaysafoundationforfurtherstudyofth

6、ebiologicalcharacteristicsofLLOandthepathogenesisofListeriamonocytogenes・[Keywords]listeriolysin0；Listeriamonocytogenes；monoclonalantibody产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一种胞内生长、兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，是李斯特菌属中致病性最强的一种。LM是一种重要的食源性病原菌,能引起人兽共患李斯特菌病[1]。在动物中，对多种畜禽均有较高的致死率；在人类，主要表现为脑膜炎、流产以及免疫缺陷患者和新生儿的中

7、枢神经系统的感染[2,3]o近年来,欧美许多国家均有过李斯特菌病暴发的报道,■■■因此对LM的研究具有重要的公共卫生意义。LM的致病性由多种毒力因子决定，包括李斯特菌溶血素(listeriolysin0,简称LLO).ActA蛋白、侵染性蛋白p60、内化素和磷脂酶C等[4],其中LLO是由LM特有的毒力标志基因hly编码的分泌蛋白，是LM的主要毒力因子。LLO是一种能结合胆固醇,可被疏基活化的细胞溶解素，相对分子质量(Mr)为60000[5]oLLO能够溶解宿主细胞吞噬体膜，使LM能够逃离噬菌体中的杀菌物质，从而在胞质中增殖。