基于核酸分子检测的肉类源性成分快速鉴别技术的开发与应用

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1、分类号：Q523单位代码：10159密级：公开学号：201010022博士学位论文中文题目：基于核酸分子检测的肉类源性成分快速鉴别技术的开发与应用英文题目：DevelopmentandApplicationofRapidandConvenientIdentificationTechnologyofMeatSourceComponentsbasedonNucleicAcidMolecularDetection论文作者：李欣南指导教师：关一夫教授学科专业：生物化学与分子生物学完成时间：2018年10月I中

2、国医科大学博士学位论文基于核酸分子检测的肉类源性成分快速鉴别技术的开发与应用DevelopmentandApplicationofRapidandConvenientIdentificationTechnologyofMeatSourceComponentsbasedonNucleicAcidMolecularDetection论文作者：李欣南指导教师：关一夫申请学位：理学博士培养单位：生命科学学院一级学科：生物学二级学科：生物化学与分子生物学研究方向：源性成分鉴别、分子生物学论文课题起止时间：201

3、3年12月—2018年4月论文完成时间：2018年10月中国医科大学（辽宁）2018年10月中国医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明:本论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果,论文中除加以标注的内容外,不包含其他人或机构己经发表或撰写过的研究成果,也不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本研究提供贡献的其他个人和集体均己在文中进行了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。淑作名:乃饺箩甲日期:冫/ε年/冫月￠日中国医科大学学位论文版权使用授权书本学位论

4、文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版,允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密(),在年后解密适用本授权书。(保密:请在括号内划“”√)日期:'`a年″月日日期:d?舴洲日≠∥中国医科大学博士学位论文摘要目的：2013年5月8日，国务院总理李克强在国务院常务会议中特别提出“严厉打击肉类产品掺假售假等违法违

5、规行为”。从2013年1月欧洲马肉事件到近期报道的鼠肉冒充羊肉串和狐狸肉冒充牛羊肉等等，“掺假肉”不停地冲击着肉品市场，带来了巨大的负面影响。其中最值得关注的是掺杂鼠肉、狐狸肉、貉子肉和貂肉。由于在饲养皮毛动物的过程中缺乏严格的检疫程序，其肉源可能携带大量细菌、病毒、寄生虫及过敏源。此外，为了保证皮毛的质量，喂养皮毛动物的饲料中含有大量的重金属、激素、抗菌素以及抗病毒药物等物质，造成此类肉源内有毒有害物质严重超标，食用此类肉源将会对人的健康产生巨大的危害。在监管鼠、狐狸、貉子和貂肉源性成分方面，我国面

6、临的三个困境。第一，虽然我们必须严格遵守我国行政法规和法律依据实施监管，但是目前我国并没有明确的法律规定鼠肉、狐狸肉、貉子肉、貂肉等不得食用。第二，虽然食品监管部门应该对此种肉类掺假问题进行严格监管，但是我国掺杂肉鉴别检测标准存在着较大空白，尤其像鼠、狐、貉和貂这些特殊的肉源成分。目前，我国尚无统一的检测方法和标准，且在现有检测其他肉源性成分的标准体系中也没有可以同时检测多种源性成分的检测方法和标准。第三，由于肉类产品具有流通量大和保质期短等特点，在实验室条件下常用的定量和定性检测方法很难满足实时的、

7、快速的、大批量产品检测的需求，因此亟待开发出高通量、快速、便捷、准确的肉源性成分的快速检测技术及产品。本论文基于国家食品监管的完善和肉品市场的检测需求，结合本实验室的快速核酸识别技术优势，以鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分为研究对象，开展了肉源性成分快速检测技术的研究与应用。方法：1、本研究利用生物信息学技术确定了具有特异性的核酸序列，用以作为检测的基因靶点。2、利用引物设计软件Primer5.0、DNAMAN和PrimerExplorerV4，设计了一系列的引物，并对其特异性进行了筛选和验证。3、利用动

8、物血液/细胞/组织DNA提取试剂盒提取靶基因的DNA。4、利用紫外-可见光谱确定DNA含量。5、利用琼脂糖凝胶电泳分析了PCR、MPCR、LAMP、RCA扩增产物和酶切产物。6、利用等温环介导方法筛选扩增引物，并对影响LAMP反应的主要因素进行了单因素考察，确定最佳LAMP反应体系。7、利用滚环复制扩增（RCA）方法对设计的识别探针的特异性和有效性进行筛选。8、利用正I中国医科大学博士学位论文交实验方法优化DNAzyme过氧化发光信号放大体系实验条件。结