转录因子ZNF326调控ERCC1表达促进非小细胞肺癌的增殖

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1、分类号：734.2单位代码：10159密级：公开学号：201510049博士学位论文中文题目：转录因子ZNF326调控ERCC1表达促进非小细胞肺癌的增殖TranscriptionfactorZNF326promotesproliferationinnon-small英文题目：celllungcancercellsbyregulatingERCC1expression论文作者：吴晶晶指导教师：王恩华教授学科专业：病理学与病理生理学完成时间：2018年11月中国医科大学博士学位论文中国医科大学博士学位论文转录因子ZNF326调控ERCC1表达促进非小细胞肺癌的增殖Trans

2、criptionfactorZNF326promotesproliferationinnon-smallcelllungcancercellsbyregulatingERCC1expression论文作者吴晶晶指导教师王恩华教授.申请学位医学博士培养单位基础医学院一级学科基础医学二级学科病理学与病理生理学.研究方向病理学与病理生理学论文起止时间2016年3月—2018年11月论文完成时间2018年11月中国医科大学（辽宁）2018年3月I中国医科大学博士学位论文II中国医科大学博士学位论文摘要目的:肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,在所有的恶性肿瘤中,肺癌的死亡率最高,并且在

3、发展中国家其发病率有快速上升的趋势。近年来，越来越多研究表明多种C2H2型锌指蛋白与肺癌的发生发展密切相关。而ZNF326则是一种新近被发现的C2H2型锌指蛋白，然而，目前对于ZNF326在肺癌中发挥的作用尚未有研究报道，而在三阴性乳腺癌的相关研究中其作为一个抑癌基因发挥作用。研究发现ZNF326在三阴性乳腺癌细胞系中为低表达，干扰ZNF326的表达后不仅可上调与EMT和癌症干细胞相关的基因表达，而且可以促进裸鼠皮下的成瘤能力。众所周知，不同的锌指蛋白分子可能发挥着促癌或抑癌的不同作用，而同一种锌指蛋白在不同的肿瘤中也可能发挥着相反的作用。ZNF326蛋白的分子结构（含有

4、转录激活区和C2H2锌指结构）特点具备了作为转录因子的可能性，然而其调控的靶基因却一直不清楚。如果ZNF326可以作为一个转录因子,那么它在肺癌的发生发展中发挥什么作用，究竟是一个癌蛋白还是一个抑癌蛋白以及其作用的靶基因和调控的机制等问题成为了我们实验研究的出发点。本文通过结合体内外的试验结果，旨在揭示ZNF326作为转录因子在非小细胞肺癌发生发展中发挥的作用及其相关作用的分子机制。研究方法：本研究主要通过染色质共沉淀测序的方法，分别对使用ZNF326抗体及Myc-tag标签抗体共同结合的DNA片段进行测序分析，然后筛选出位于启动子区DNA片段的可能靶基因。双向调控ZNF

5、326的蛋白表达后，用RT-PCR检测潜在靶基因的mRNA变化水平，萤光素酶报告基因及凝胶迁移实验等方法明确其与靶基因的具体结合序列。建立稳定转染ZNF326质粒和shZNF326干扰序列的H1299细胞系，并将其注入裸鼠皮下，观察其皮下成瘤能力；并通过体外克隆形成、细胞增殖、流式细胞学、基质胶侵袭、免疫印迹实验检测在双向调控ZNF326蛋白表达后H1299和A549细胞在细胞增殖能力、迁移能力以及周期和迁移相关蛋白的变化，并验证该作用是否通过其靶基因ERCC1发挥作用。结果:1、ZNF326在体内外均具有促进非小细胞肺癌增殖的作用：转染ZNF326质粒的H1299细胞组

6、所形成的移植瘤体积、重量明显大于对照组(p<0.05)，转染sh-ZNF326组的H1299细胞移植瘤体积和重量则明显小于注射了shNC组(p<0.05)。转染ZNF326可促进H1299和A549细胞的增殖和克隆形成能力(p<0.05)，而干扰ZNF326的表达后抑制其增殖和克隆形成能力(p<0.05)。ZNF326III中国医科大学博士学位论文在支气管上皮及肺泡组织中为阴性表达，在腺癌和鳞癌细胞核中高表达。ZNF326在肺癌组织标本(82/146)中高表达，并且其高表达与非小细胞肺癌的低分化、高pTNM分期密切相关（p<0.05）。ZNF326促进非小细胞肺癌迁移能力

7、：转染ZNF326质粒后，A549及H1299细胞的迁移能力增强，而干扰ZNF326表达后其迁移能力侵袭能力均减弱(p<0.05)。2、ERCC1是ZNF326的靶基因：ZNF326抗体与Myc-tag标签抗体共同结合的DNA主要位于启动子区、外显子区、内含子区及基因间区，共同片段有278个；转染ZNF326上调ERCC1的mRNA水平，干扰ZNF326的表达，ERCC1的mRNA水平下调(p<0.05)。在H1299及A549细胞中转染ZNF326，ERCC1的萤光素酶报告基因活性增强，干扰ZNF326，ERCC1的萤光素酶