闭锁小带-1相关核酸结合蛋白（ZONAB）促进膀胱癌侵袭作用的研究

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1、中国医科大学博士学位论文分类号：H1619单位代码:10159密级：公开学号:200910251博士学位论文中文题目：闭锁小带-1相关核酸结合蛋白（ZONAB）促进膀胱癌侵袭作用的研究英文题目：Thestudyontheinvasion-promotingroleofzonulaoccludens-1associatednucleicacidbindingprotein(ZONAB)inbladdercancer论文作者：许学文指导教师：吴斌教授学科专业：泌尿外科学论文完成时间：2018年10月中国医科大学博士学位论文中国医科大学博士学位论文闭锁小带-1相关核酸结合

2、蛋白（ZONAB）促进膀胱癌侵袭作用的研究Thestudyontheinvasion-promotingroleofzonulaoccludens-1associatednucleicacidbindingprotein(ZONAB)inbladdercancer论文作者：许学文指导教师：吴斌教授申请学位：医学博士培养单位：第二临床学院一级学科：临床医学二级学科：外科学研究方向：泌尿外科学论文课题起止时间：2009年9月-2018年10月论文完成时间：2018年10月中国医科大学（辽宁）2018年10月中国医科大学博士学位论文中国医科大学博士学位论文摘要目的：紧密连

3、接（tightjunction,TJ）是癌细胞侵袭转移过程中必须克服的首要屏障。癌细胞首先丧失细胞间连接，由原发灶解离，然后侵袭周围组织。闭锁小带-1相关核酸结合蛋白（zonulaoccludens-1associatednucleicacidbindingprotein，ZONAB）是重要的紧密连接蛋白，也是转录因子，细胞密度增加时ZONAB结合于闭锁小带-1（zonulaoccludens-1,ZO-1），处于未激活状态,ZONAB被激活后进入细胞核，特异性地结合cyclinD1、增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,P

4、CNA）的启动子，起到促进细胞增殖的作用。在肝癌、结肠癌中ZONAB的表达上调，发挥促进癌细胞增殖的作用，但目前尚缺乏膀胱癌（bladdercancer,BC）中ZONAB表达情况的报道，虽然ZONAB作为转录因子促进细胞增殖的作用已被人们所知，而它能否影响肿瘤侵袭仍是未知数。本研究的目的是通过基因转染、离体实验、在体实验等多种方法，检测ZONAB在膀胱癌中的表达变异，并证明ZONAB表达对癌细胞侵袭力的影响,揭示膀胱癌侵袭的可能机制。研究方法：1、研究对象：选取患者为2014年至2016年之间于中国医科大学附属盛京医院医院泌尿外科收治并接受手术治疗，病理确诊尿路上

5、皮癌,排除不合并泌尿系感染病变，包括30例肌层浸润性膀胱癌、41例非肌层浸润性膀胱癌和相应的癌旁非肿瘤组织（adjacentnon-tumortissue,ANTT）。研究样本取自手术切除的肿瘤组织和癌旁组织，其中部分组织固定后行病理检查及免疫组化实验，部分组织转移至-80℃冰箱中冻存。人尿路上皮永生细胞系sv-huc-1和膀胱尿路上皮癌细胞系5637、T24、UM-UC-3由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)购得。2、ZONAB过表达T24多克隆细胞系构建：在氨苄青霉素LB培养基中培养pLV-ZONAB-DU及其对照组pLV-GFP-DU菌液,收集菌体提

6、取质粒，用紫外分光光度计测量OD260值,计算质粒浓度,慢病毒载体、pH1、pH2转染HET293T细胞，收集纯化病毒，将慢病毒悬液加入有T24细胞生长的完全培养基，然后加入凝聚胺至终浓度，以此替换原细胞培养基,加入嘌呤霉素筛选细胞，14天后冻存细胞。3、用shRNA使ZONAB表达沉默：根据ZONAB基因序列设计合成shRNA序列，用大肠杆菌提取质粒，慢病毒载体、pH1、pH2转染HET293T细胞，收集纯化病毒，用病毒感染UM-UC-3细胞，加入嘌呤霉素筛选细胞，14天后冻存细中国医科大学博士学位论文胞。4、Transwell细胞体外侵袭实验：将被稀释的基质胶加

7、入transwell培养板上室,覆盖聚碳酯膜，上室加入单细胞悬液。下室加入趋化因子液，1天后去除基质胶和聚碳酯膜上表面的细胞。甲醇固定上室，苏木素染色，梯度乙醇脱水,二甲苯透明，切取聚碳酯膜,放置于载玻片，中性树脂封片。在高倍镜下计数细胞。5、动物模型的制备：将各组T24细胞于裸鼠的双上肢腋下进行皮下注射，记录裸鼠瘤体各径线。6、Westemblotting技术：检测膀胱组织、培养的各组细胞系中各种蛋白的表达水平。7、realtime-PCR技术：检测膀胱组织、培养的各组细胞系中各种mRNA表达水平。8、免疫组化技术：观察和检测膀胱组织中各种蛋白的表达分布及强弱