原位杂交组织化学

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1、第五章原位杂交组织化学第一节原位杂交组织化学基本原理(insituhybridization)原位杂交组织化学，简称原位杂交(ISH)，是将分子杂交与组织化学相结合而在核酸原有的位置进行细胞内核酸定性、定位的一种技术。当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或pH恢复到中性（复性），单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。无论两条单链来源是否相同，只要它们之间的碱基顺序互补或者部分互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性，产生分子杂交。原位杂交技术在生命科学研究中可视为一项革命性进步。它使医学研究从器官、组织、细胞水

2、平发展到分子水平。为各个学科的研究带来突破性进展。其中特别是细胞或组织的重要基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学的基础研究。第三节核酸分子探针核酸探针是指带有标记物的已知碱基序列的核酸片段，它仅与靶核酸即待测核酸反应，是用于组织细胞内的特定核酸序列定位的关键试剂。探针的种类基因组DNA探针cDNA探针cRNA探针寡核苷酸探针探针的标记放射性同位素3H、35S或32P非放射性标记物生物素或地高辛的间接标FITC或者罗丹明对探针分子进行直接标记探针标记方法第四节原位杂交组织化学基本程序标本制备杂交前处理杂交反应杂交后处理检测杂交信号，进行结果分析。一、标本制备取材：防止外原性RNA酶引起靶组

3、织中RNA丢失，高压消毒，焦碳酸二乙酯（DEPC，RNA抑制剂）处理。固定固定剂：4%多聚甲醛固定方法：浸润法，灌注法切片冰冻切片：最常用，操作带手套，70%酒精檫洗工作台石蜡切片：用含有DEPC的双蒸水加温展片。培养细胞二、杂交前处理增强组织通透性和核酸探针穿透性0.2%~0.5%TritonX-100的PBS内处理15min蛋白酶K1μg/ml，37℃孵育15~30min减低背景染色酸酐和稀酸处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，降低背景。0.25%乙酸酐处理10min预杂交：用不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本1~2h内源性生物素和酶的抑制三、杂交反应双链DNA探针和靶D

4、NA变性杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。杂交液甲酰胺：可使Tm降低，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖：能与水结合，提高探针有效浓度。牛血清白蛋白：阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。探针长度50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。探针浓度0.5-5.0μg/ml。杂交温度和时间大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便，将杂交液和标本孵育过夜四、杂交后处理杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗盐浓度由高到低，而温度由低到高，漂洗10～15min。

5、高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。漂洗过程中，必须注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量溶液漂洗也很难减少非特异性结合。五、杂交体检测放射性同位素标记探针的检测放射性同位素标记探针的杂交信号可用放射自显影术检测。利用感光乳胶记录被研究材料中放射性物质分布和定位。非放射性标记探针的检测常用非放射性标记物多为半抗原，以半抗原标记探针的原位杂交信号可通过免疫酶组织化学或亲合组织化学技术显示。放射性同位素标记探针的检测非放射性标记探针的检测六、对照试验组织对照Southern或Northern印迹免疫组织化探针对照已知阳性组合和阴性组织对照用有意义链RNA探针做杂交吸收实验探针与互补DNA

6、或RNA杂交杂交反应对照空白对照杂交前用核酸酶预处理检测系统对照放射自显影空白片的阳性对照和阴性对照非放射性原位杂交同免疫组织化学技术对照第五节原位杂交组织化学技术进展原位PCR技术荧光原位杂交技术胚胎原位杂交技术双重和多重原位杂交技术原位杂交结合免疫组织化学技术电镜原位杂交技术肽核酸原位杂交原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。固定组织蛋白酶K消化PCR扩增显微镜观察dNTP--荧光素或dNTP-地高辛-生物素或荧光染料－抗地高辛抗体－抗生物素抗体一、原位PCR技术二、荧光原位杂交技术(Flu

7、orescentinsituhybridization,FISH)原理:一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。直接FISH间接FISH1.直接FISH将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上不同荧光素，在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交，因所形成的杂交体带有荧光素，故可在荧光显微镜下直接观察，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(T