凝胶色谱样品前处理

《凝胶色谱样品前处理》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、凝胶色谱样品净化技术丁明玉清华大学化学系dingmy@mail.tsinghua.edu.cn报告内容报告内容1.凝胶色谱分离原理及应用领域2.凝胶色谱样品净化技术1.凝胶色谱分离原理及应用领域�凝胶色谱：以多孔凝胶为固定相，利用凝胶孔的空间尺寸效应，使不同大小的分子达到分离的HPLC方法。凝胶的网络结构溶质分子进入凝胶网络中凝胶色谱分离机理�分离机理：类似于分子筛效应。大体积分子只能渗入少量大孔，在固定相中所经历的路径较短，先流出。所有孔隙都不能进入的大体积分子，不被保留，在死体积流出。�洗脱顺序：溶质按分子体积从大到小依次流出。凝胶色谱法的类型�又称：空间排斥色谱、体积排阻色谱。�凝胶色

2、谱（gelchromatography）分为：凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC）：以有机溶剂为流动相；凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水为流动相。�流动相不影响溶质在两相的分配系数Kp（渗透系数）。凝胶孔径与分配系数Kp渗透（分配）系数Kp为平衡时溶Kp=[Xs]/[Xm]质在固定相和流动相中的浓度比。KP=1KP=0KP=0-1�排斥极限：不能进入所有凝胶孔的最小分子量(KP=0)。�全渗透点：所有凝胶孔都能进入的最大分子量(KP=1)�分子量范围：排斥极限(KP=0)与全渗透点(KP=1)之间的

3、分子量范围。在此范围内，分子量越大，KP越小。�固定相选择原则：前处理应尽可能使大分子不能进入所有孔。保留体积与渗透系数的关系�凝胶色谱的保留值常用保留体积Ve(淋洗体积)表示。其保留体积与渗透系数的关系：VSV=V0(1+Kp⋅)V0为死体积eVmVm为凝胶颗粒间体积，近似等于V0;Vs为凝胶孔隙的总体积。所以，Ve=V0+Kp⋅VS�此式表明，分子尺寸(分子量)越大，因其Kp越小，所以其保留体积越小，出峰越快。凝胶色谱固定相�软质凝胶：如葡聚糖。因其不耐压（0.1MPa左右即被压坏），只能用于凝胶层析（低压凝胶色谱）。�半硬质凝胶：如聚苯乙烯凝胶。能耐较高压力，可用于GPC。具有可压缩性

4、、能填充紧密、柱效高。但在有机溶剂中的溶胀性会导致孔径发生变化。�硬质凝胶：如多孔硅胶和多孔玻璃珠。在有机溶剂中不溶胀、孔尺寸固定。但不易装填紧密、装柱时易碎，所以柱效较低。对蛋白质有吸附；不能在强酸性和强碱性条件使用。凝胶色谱流动相�既能充分溶解样品，又能润湿凝胶。�溶剂粘度要低，否则，会限制分子扩散而影响分离效果。�通常，水溶性试样选水作流动相；非水溶性试样选四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等非极性有机溶剂。凝胶色谱检测技术�示差折光检测器是最常用的浓度检测器；�HPLC的其他检测器原则上都可用；�峰高（峰面积）与溶质浓度（溶质数目）成正比。�如果把图中的横坐标Ve转换成分子量M就成了

5、分子量分布曲线。�将Ve转换成M需要借助校正曲线。在多孔填料的渗透极限范围内，Ve和M有如下关系：lgM=A－BVe（式中A、B为与聚合物、溶剂、温度、填料及仪器有关的常数）凝胶色谱的主要用途�高分子分子量的测定；�高分子分子量分布的测定；�中小分子有机物的定量分析；�生物大分子纯化；（制备凝胶色谱）�指纹图谱；（原油及其重质组分的评价）�样品净化（预处理）。凝胶色谱样品净化装置LabTechLabTechAutoCleanGPCCleanup-600分子量的测定方法�凝胶柱的标定：用一系列已知相对分子质量M的标准品（最好与样品属相同化学组成），测定它们在该凝胶柱上的保留体积Ve（或保留时间

6、），绘制lgM-Ve曲线。分子量的测定方法�样品分析：在相同条件下，得到样品色谱图，根据保留体积即可得到其对应的相对分子质量。而且峰面积（峰高）与分子数目成正比。�根据各色谱峰对应的分子量、峰面积及相应的公式，还可计算数均相对分子量、重均相对分子量、黏均相对分子量和Z均相对分子量。低聚聚苯乙烯的分析色谱柱：2xOligoPore300x7.5mmPolystyrene1270淋洗液：THF流速：1.0ml/min进样体积：100µl检测器：DRIPolystyrene580邻苯二甲酸二烷基酯的分析柱:2xPLgel3µm�可选择微孔较小的固定相；100Å300x7.5mm；�采用外标法定量淋

7、洗液:THF；1:邻苯二甲酸二辛酯(390g/mol)34流速:1.0ml/min；122:邻苯二甲酸二丁酯(278g/mol)进样体积:20µl；3:邻苯二甲酸二乙酯(222g/mol)检测器:DRI4:邻苯二甲酸二甲酯(194g/mol)5:甲苯5蛋白质纯化：脱盐�粗产品：含无机杂质盐的蛋白质水溶液；蛋白质�可以采用凝胶过滤色谱（GFC）。�固定相选择：凝胶孔比蛋白质小。生物产品中无机杂质的脱除：GFC生