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1、高效毛细管电泳实验一、实验目的1.进一步理解毛细管电泳的基本原理；2.熟悉毛细管电泳仪器的构成；3.了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。二、实验原理1.电泳淌度毛细管电泳（CE）是以电渗流（EOF）为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品屮组分Z间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相微分离技术。离子在自由溶液屮的迁移速率可以表示为：v=
2、1E（1）式中v是离子迁移速率，卩为电泳淌度，E为电场强度。T］为介质粘度，r为离子的流体动力学半径，q为荷电量。因此，离子的电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈反比。2.电渗流和电渗淌度电渗流（EOF）指毛细管内壁表
3、面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。在水溶液屮多数固体表面根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷。就石英毛细管而言，表面的硅疑基在pH大于3以后就发生明显的解离，使表面带有负电荷。为了达到电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在表面附近，从而形成所谓双电层，如图1所示。这样,双电层与管壁之问就会产生一个电位差，叫做Zeta电势。但毛细管两端施加一个电压时，组成扩散层的阳离子被吸引而向负极移动。由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向负极运动，这便形成了电渗流。电渗流的大小可用速率和淌度来表示:(3)(4)或者EOF=（
4、隽/〃）E式中vEOF为电渗流速率，（1EOF为电渗淌度，£为Zeta电势，£为介电常数。3.毛细管电泳的分离模式CE有6种常用的分离模式,其中毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱（MEKC）和毛细管电色谱（CEC）最为常用。本实验的内容为CZE。1.毛细管电泳的基本参数CE屮的分析参数可以用色谱屮类似的参数来描述，比如与色谱保留时间相对应的有迁移时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率(v)则是迁移距离(1,即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离，又称毛细管的有效长度)与迁移时间(t)之比：/V=-t(5)因为电场强度等于施加电压(
5、V)与毛细管长度(L)之比：L(6)就CE的最简单的模式一毛细管区带电泳(CZE)而言，结合式(1),可得：ZIL"疋F(7)在毛细管区带电泳(CZE)条件下测得的淌度是电泳淌度与电渗流淌度的矢量和，我们称之为表观淌度Z，即：Pa⑻实验中可以采用一种屮性化合物，如二甲亚矶或丙酮等，来单独测定电渗流淌度，然后求得被分析物的有效淌度。三、仪器及试剂HP3D电泳仪。5mL移液管2只,ImL移液管共2支,分别标上四种标样的标签。10mL容量瓶2个，滴管2支，分别标上标准、未知的标签。塑料样品管若干个，分别用于标准样品、未知样品、三种缓冲溶液、HC1、NaOH、二次水和废液，做
6、好标号。微量白动移液枪，酸度计。标样：苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸，均溶于二次水中，浓度l.OOmg/mL,作为标准品，混合稀释作为标样。另有一个预先配制的未知浓度混合样品。缓冲溶液(buffer)：10mmol/LNaH2PO4-Na2HPO41:1缓冲溶液(NaH2PO4和Na?HP04各5mMol/L),20mmol/LHAc-NaAcpH为6(HAc:NaAc大约1:15)缓冲溶液,20mmol/LNa2B4O7缓冲溶液。0」moI/LNaOH溶液，二次去离子水。四、实验步骤1.仪器的预热和毛细管的冲洗：在实验教师的指导下，打开仪器和配套的工作站。工作
7、温度设置为30°C,不加电压，冲洗新毛细管，顺序依次是：lmol/LHCl溶液30min二次水5min,1mol/LNaOH溶液30min,二次水5min,10mmol/LNaH2PO4-Na2HPO41:1缓冲溶液5min,两次运行之间依次用0.1mol/LNaOH2min,二次水2min,缓冲液5min01.混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制混合标样。分别用5mL的移液管移取3mL苯甲醇、3mL苯甲酸，用ImL的移液管移取ImL水杨酸、0.5mL对氨基水杨酸于10mL的容量瓶屮，定容，得到苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸浓度分别为3OOgg/mL>3OOp
8、g/mL、lOOpg/mL、5O.Opg/mL的混合溶液作为混合标样。（试思考为什么不采用浓度一样的混合溶液作为混合标样？）2.混合标样的测定：待毛细管冲洗完毕，取50yL混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪样品盘（Tray）屮，进样压力50mbar,进样时间5s。然后开始分析，电压25kV。3.未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，。4.不同缓冲溶液下迁移时间的变化：未知浓度混合样品的测定完毕后，冲洗毛细管，顺序依次是：0.1mol/LNaOH溶液5min,二次水5min,然后更换缓冲溶液为20mmol/LNa2B4O7,冲
