蒙古旱獭疫源地鼠疫宿主动物DNA条形码研究

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1、蒙古旱獭疫源地鼠疫宿主动物DNA条形码研究1.内蒙古自治区地方病防治研究中心呼和浩特010031【摘要】［目的］为了探究应用DNA条形码技术对鼠疫宿主动物进行分子牛物学鉴定的可行性。［方法］木研究检测了内蒙古蒙古旱獭疫源地6种啮齿动物的75条线粒体COI基因657bp的片段序列，用MEGA5.0软件计算GC含量,经过双参数法计算遗传距离，釆用邻接法（NJ）构建分析系统发育树。［结果］所有序列富含AT,所有物种G含量及第3位的G含量均较少，各鼠种碱基含量随着物种以及密码子位置的不同而不同。种内平均遗传距

2、离为0.1%,不同鼠种间平均遗传距离为22.63%,NJ进化树能清楚的区分6个不同的类群。［结论］内蒙古蒙古旱獭疫源地的鼠疫宿主动物通过COI基因应用DNA条码技术可以进行鉴别，同时认为近年蒙古旱獭疫源地达乌尔黄鼠为优势种。【关键词】DNA条形码;COI基因；鼠疫【中图分类号】Q342+.2【文献标识码］A【文章编号】2096-0867（2015）-10-006-02蒙古旱獭疫源地处于呼伦贝尔高原北部草原地带，东经115°50′〜121°18′,北纬48°

3、;20′〜49°50′Z间，其范围涉及满洲里市和陈巴尔虎旗、新巴尔虎左旗、新巴尔虎右旗、鄂温克旗及牙克石市的一些地区。根据70年代后期动物病调查队的调查和80年代以来系统的鼠疫监测结果，在该疫源地共发现各种啮齿动物21种［1］。但近年来在蒙古旱獭疫源地共获鼠14种［2］,其中常见种有达乌尔黄鼠、长爪沙鼠、蒙古旱獭、黑线毛足鼠、五趾跳鼠等，蒙古旱獭为优势种，在该疫源地2000-2011年见共有2种啮齿动物（达乌尔黄鼠和五趾跳鼠）自然感染鼠疫，为了准确了解疫源地内啮齿动物的

4、种类和数量，现利用DNA条形码方法结合形态鉴定对蒙古旱獭疫源地内的鼠疫宿主动物进行鉴定研究。1材料和方法采集内蒙古自治区呼伦贝尔高原蒙古旱獭鼠疫自然疫源地内的啮齿动物，现场初步进行鼠种形态鉴定，同吋进行性别、年龄鉴定和体尺测定后，带回实验室解剖取肝脏组织，・80°C冷藏保存备用，实验样品信息见表啮齿动物肝脏组织基因组DNA提取方法按照TaKaRa试剂盒指导书(D305A)的操作步骤进行。扩增吋所用引物及使用条件参考Robins等⑶(2007)的鼠类通用引物和Ivanova等[4](2007)的鸡尾酒引

5、物，并由上海生工生物技术有限公司合成。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检验样品的完整性，检测合格的PCR产物直接送上海生工双向测序。同一份样品进行3次PCR试验，测序吋应用自带的鸡尾酒引物。测序成功的序列首先用Chromos软件观察测序峰图质量,如果峰图质量很差，不能准确判断碱基，则重新进行扩增和测序。再用ClustalX软件进行多重序列比对，并进行适当的手工调整。然后将测定的序列在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较，以确保所获得的序列是目标序列。最后运用Mega5软件分析各基因序列的碱

6、基织成和变异，基于K2P(Kimura-2-parameter)模型计算各物种的遗传距离。采用邻接法构建全部COI基因序列的NJ(Neighbor-Joining)系统树，对NJ树进行内部分支检验与1000次Bootstrap检验分析，来确定各支系的置信度。农1实验样品信息2结果与分析本文共获得75条COI基因序列片段(每条序列长度657bp),对所有序列的阅读框架进行确认，避免核基因组中的假线粒体基因序列干扰。75个样本属于2目5科6属6种。2.1COI基因序列分析2.1.1变异位点分析对6种啮齿动

7、物75条序列COI进行比对，发现有变异位点234个。所有DNA条码都是物种所独有，不存在物种之间的共享;对所涉及的6个物种，每个物种都有各自的鉴别位点。2.1.2GC含量分析各种碱基含量随着物种和密码子位置的不同而不同。达乌尔鼠兔和五趾跳鼠核昔酸含量C>T>A>G,而其他4个鼠种的核昔酸含量T>A>C>；G，其差别主要来自于C碱基含量的差别。这些序列人部分是富含AT,GC含量差别较大。五趾跳鼠和达乌尔鼠兔的GC含量较高，而达乌尔黃鼠的GC含量则较低（见表2）。该差别来

8、源于密码子第1、3位的GC含量的差别，主要是第3位的差别所致（见表3）,第2位的GC含量几乎无差别。所有物种第3位的G含量均较少。表2各鼠种碱基含量表（AV±SE）表3各鼠种不同密码子位置GC%含量表（AV±SE）2.2K2P遗传距离分析2.3进化树分析基于COI序列，应用邻位相连法（NJ）构建的进化树图中可看出，各鼠种被分成各自不同的类群，能清处的区分6个不同的品种。3•讨论Hebert等［50选取COI基因对动物不同种群进