《食品酶学第三章》PPT课件

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1、第三章酶的分离和纯化技术本章重点各种分离方法的操作原理分离方法的应用原则酶分离纯化中应注意的问题酶制剂的来源解决问题？如何提高酶的回收率和纯度质量Purpose？获得一定量的、不含有或少含杂质的酶制剂或者提纯为结晶，以利于在工业生产或科学研究中应用建立一个可靠和快速的检测酶活与纯度的方法，并对整个分离过程中每一步始终贯穿酶活力的测定。了解所分离酶的结构与性质特点以及酶在细胞中的存在状态。明确原料的特性与数量。了解各种方法的原理特性和优缺点并选择有效的分离纯化方法。各种方法的使用顺序安排合理。时刻防止酶的变性，操作要在温和或低温的条件下进行。要充分考虑到介质与溶液体系中各种因子的

2、影响和实际的实验条件。考虑因素本章主要内容第一节酶的分离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的分离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准表3－1从E.coli中分离、纯化天冬酰胺酶步骤总蛋白含量/mg总活力×107U比活力/U.mg-1回收率％提纯倍数匀浆1.4×10828.621001酒精粗沉淀4.1×10614.3355017.540℃调pH4.59.5×10511.41204060上清液DEAE纤维素柱6.5×1059.01403270CM纤维素柱层析3.0×1056.020021100结晶2.2×1054.822017110重结晶1.7×1053.822017

3、110从表3－1可知，随着分离、纯化过程，酶的比活力越来越高，提纯程度越来越高，其提纯倍数也越来越大，而其总活力、回收率相对降低。一般试剂级及药品级酶纯度要求高，则采取提纯倍数高的方法。工业用酶对纯度要求较低，其成本价格显得重要，甚至有时采用粗酶液。而食品级酶在整个分离、纯化工程中要注意卫生、防止污染，各方面均须综合考虑。本章主要内容第一节酶的分离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的分离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准第二节酶的提取一、酶原料的选择二、酶源材料的预处理三、酶的抽提一、酶原料的选择1.遵循的原则酶含量多、干扰物少；来源丰富、保持新鲜；容易得到、提

4、取工艺简单；稳定性好、安全性好；有综合利用价值等。例如：提取生姜蛋白酶应该以姜的根部为原料，提取淀粉酶则应以培养的微生物为原料。2.注意的问题1）酶存在胞内酶和胞外酶之分，一般而言，胞内酶比胞外酶难于提取。2）材料不同，同一材料不同部位或不同生长期，酶的含量不相同。如：脂肪氧化酶在大豆中的含量是在花生中含量的100倍。3）同一种酶在动物材料、植物材料、微生物材料中性质不同，安全性也不同。4）选择到合适的材料后应及时使用，防止酶的破坏。5）植物材料具有一些不利于酶提取的因素，如含有较高的纤维素、色素和单宁；细胞不易破碎；液泡中代谢物复杂等。6）动物脏器中含有较多的脂肪，容易氧化酸

5、败导致原料变质，影响纯化操作和酶的得率。7）微生物具有种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节地点影响等优点，并且可以通过微生物培养方法富集诱导酶，因此已成为制备酶的主要材料之一。8）采集的材料在正式进行酶的提取之前，一般都要进行一定的前处理，去除明显可见的杂质和干扰物质。二、酶源材料的预处理（胞内酶）机械破碎法物理方法酶解法表面活性剂处理法丙酮粉法机械破碎法包括研磨法和细菌磨法研磨法细菌磨法——此法比研磨法省力，其破碎率也比研磨法效率高。细菌磨结构示意图物理方法超声波破碎法渗透压法冻融法基本原理是利用超声波（10-15KHz）的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生时的空化

6、作用，致使液体形成局部减压引起液体内部产生很大的压力导致细胞破碎。先将细胞置于高渗溶液（如蔗糖溶液）中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水溶液中，细胞壁会因为渗透压的突然变化而破碎。将细胞在低温（-15℃）下冰冻后在在室温下溶化，如此反复多次就能使细胞壁破裂。此法也只适用于细胞壁易破的细胞。冻融过程要迅速，不能很长时间（速冻速溶）酶解法用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶（如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等）在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。例如：用酶法破碎酵母细胞时，需要先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构；甘露糖酶可以专一的水解细胞壁上的甘露糖，使得细胞壁的结构破坏。另外再加入

7、葡聚糖酶作用于葡聚糖层。最后改变渗透压使细胞膜破裂，胞内物质溶出。表面活性剂处理法在适当的温度、pH值及低离子强度下，表面活性剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其它蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。丙酮粉法丙酮粉法的原理是利用丙酮能使细胞迅速脱水并破坏细胞壁的作用。具体操作：细胞离心收集菌体加入冷却的丙酮液搅拌抽滤反复用冷丙酮液洗涤置干燥器中低温保存。经丙酮处理的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细