细胞分子生物学（扬州大学）细胞分子生物学实验

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1、质粒DNA的小规模制备课程名称：细胞分子生物学实验学时：3学时一、实验目的1•了解碱裂解法制备质粒DNA的基本原理；2.掌握碱裂解法的具体操作方法和注意事项。二、实验原理（或背景知识》碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异來分离它们。在pH值介于12.0〜12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭

2、合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分了RNA,蛋白质・SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料（-）仪器1•微量移液器（20

3、iL,200pL,1000

4、iL）2.恒温摇床3.台式高速离心机4.高压蒸汽灭菌锅（二）材料_1・含pUC18质粒的E.coliDH5a菌株2.1.5mLeppendorf管及管架、tips3.葡萄糖、三疑甲基氨基甲烷（Tris

5、）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、盐酸（HC1）、饱和酚、氯仿、界戊醇、ddH2O（三）试剂1.LB液体培养基蛋白豚10g酵母提取物5gNaCl10g溶于800mLddHpO中，用1ONNaOH溶液调节pH至7.5,加去离子水至总体积1L,高压灭菌20分钟。2•溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三瓮甲基氨基甲烷（Tris）TrisHCl10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）3•溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合4•

6、溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mLddH2O28.5mL5.RNaseA溶液RNaseA溶于lOmmol/LTris・Cl(pH7・5)、15mmol/LNaCl中，配成1Omg/mL的溶液，100°C煮沸15mino6.TE缓冲液10mmol/LTrisHCllmmol/LEDTA（pH8.0）7.70%乙醇（放・20°C冰箱中，用后即放冋）8.氯仿溶液氯仿：异戊醇=24：1（体积比）实验内容1.将菌种接种于LB液休培养基中，37°C振荡培养过夜。2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中

7、，12000rpm离心30s。3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于lOOpL冰预冷的溶液I屮，剧烈振荡。5.加200

8、iL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3min。6.加入150pL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5mino7・12000rpm,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中。8・加入RNaseA溶液2pL,37°C作用30min,去除RNA。9.加入等体积饱和酚/氯仿溶液（约400mL）,振

9、荡混匀，12000rpm离心5mim小心移出上层水相于一新Eppendorf管屮。10.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，・20°C放置10〜15min。12000rpm离心lOmino倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。11.用ImL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。12.50卩LTE缓冲液，使DNA完全溶解，・20°C保存。五、讨论分析1.实验操作过程中有哪些注意事项？1•质粒质量好坏与哪些操作步骤有关?六、成绩评定：1.能认真预习实验内容，教师提问优秀

10、者占总成绩20%o2.动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%。4•讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%。DNA限制性酶切及电泳分析课程名称：细胞分子生物学实验学时：3学时一、实验目的1.理解和掌握限制酶消化DNA的基本原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作步骤、凝胶的染色及注意事项。二、实验原理（或背景知识〉DNA限制性内切酶能特异切割某一核昔酸序列，从而形成亍磷酸基团和39轻基的结构。而酶切后的线性DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动吋有电荷效应

11、和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖■磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。D