DNA提取方法和试剂作用_生物学_自然科学_专业资料

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1、1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中)用酚•氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚•氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、屮间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA吋，为什么加入单价的阳离了？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离了，如NaCI或NaAc,Na+屮和DNA分

2、子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。2DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。•细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋口，如与DNA结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇

3、屮沉淀，因为DNA在醇屮不可溶而黏在一-起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也冇利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。DNA提取的几种方法(1).浓盐法A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳抽捉，得到的DNA粘液与含冇少量蛋白质氯仿一起摇荡，使乳化,再离心除去蛋口质，此时蛋口质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.B.也口J用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以lMNaCL提取脱氧核糖蛋白，

4、再按氯仿…异醇法除去蛋白.两种方法比较，后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA时•，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋口质与DNA的分离。在提取过程屮为抑制组织屮的DNase对DNA的降解作用，在氯化钠溶液屮加入柠檬酸钠作为金屈离子的烙合剂通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠，并称SSC溶液，提取DNA.(2).阴离子去污剂法；用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋口质变性,可以直接从生物材料屮提取DNA.*于细胞屮DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，凶为阴离子去污剂能够破坏这种价键，

5、所以常用阴离子去污剂提取DNA(3)•苯酚抽捉法：苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋口与DNA联结键己断，蛋口分子表面乂含有很多极性基

6、才I与苯酚相似相溶。蛋白分了溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA,然后将

7、沉淀溶于水屮，使DNA充分溶解于水屮，离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇，立即用搅拌法搅出•然后分别用66%,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤撮后在空气中干燥，既得DNA样品.此法捉取的DNA屮蛋白质含量较高，故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS.1•动物来源的DNA的提取1.1经典提取方法酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲肽胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的革础上进行的，这三种方法均利丿IJ蛋白酚K和I•二烷基硫酸

8、钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋口质，再分别用乙醇或界丙醇沉淀DNA。甲瞅胺法是利用高浓度的甲瞅胺解聚蛋白质MDNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。1.2玻璃棒缠绕法该法用盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀岀的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇

9、，由胶状逐渐冋缩，然后浸人TE屮过役，使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高，但简单快速。1.3血细胞DNA的快速提取法采用非离了变性剂NP40(乙基苯基聚乙—•醉)代替SDS裂解细胞，提取细胞核，然后用酚/氯仿抽提DNAo这样从血液小分离获得的DNA纯度高，能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween-20同时作用破碎细胞膜，以避免SDS对以后