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1、DNA提取试剂的作用1.CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)：是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃.2．Tris-HCl：提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;3.EDTA：螯合Mg2+或
2、Mn2+离子,抑制DNase活性;4.NaCl：提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;5.β-巯基乙醇：抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。6.PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.7.氯仿：使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开8.异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。氯仿是强蛋白质变性剂，抑制RNA酶的活性，除去蛋白质污染。9.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的
3、主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，10.SDS：SDS是离子型表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质变性而沉淀下来。11.3mol／L NaAc：有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。12.无水乙醇：乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合13.蛋白质的去除:酚/氯仿抽提；使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl,高盐可溶解多糖.多酚的去除:在抽提液中加入
4、防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会
5、夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。5．在用乙
6、醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6．加核糖核酸酶降解核
7、糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7
8、.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采
