纸滤, 水子 离去 或水 馏蒸 、3 ,

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1、产品名称：人25羟基维生素D3(25(OH)D3/25HVD3)ELISAKit英文名称：Human25-DihydroxyvitaminD3,HVD3ELISAKit产品分类：人代谢相关酶联免疫吸附测定试剂盒[ELISAKitforHumanmetabolism]检验方法：ELISA包装：96T人25羟基维生素D3（25（OH）D3/25HVD3）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中25（OH）D3含量。实验原理用纯化的25（OH）D3抗体包被微孔板

2、，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的25（OH）D3抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的25（OH）D3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1、酶标板：一块（96孔）2、标准品（冻干品）：2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200nmol/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在

3、板中进行倍比稀释），分别配制成200nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，25nmol/L，12.5nmol/L，6.25nmol/L，3.12nmol/L，样品稀释液直接作为空白孔0nmol/L。如配制100nmol/L标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）200nmol/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3、样品稀释液：1×20ml。4、检测稀释液A：1×10ml。5、检测稀释液B：1×10ml。6、检测溶液A：1×120/瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A1:

4、100稀释（如：10检测溶液A/990检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。7、检测溶液B：1×120/瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。8、底物溶液：1×10ml/瓶。9、浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10、终止液：1×10ml/瓶（2mol/LH2SO4）。11、覆膜：5张12、使用说明书：1份自备物品1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）2、微量加液器及吸头，EP管3、蒸馏水或去离子水，滤纸

5、标本的采集及保存1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于1000g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。3、其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此

6、项检测。操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100，余孔分别加标准品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37温育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检

7、测溶液A工作液100（临用前配制），酶标板加上覆膜，37温育1小时。3、弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。4、每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100，加上覆膜，37温育1小时。5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。6、每孔加底物溶液90，酶标板加上覆膜37避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。7、每孔加终止溶液50，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。8、立

8、即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）。注：1、试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要