第六章基因重组与基因工程

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1、第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1•熟悉基因工程、棊因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基木过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。教材内容精要一、自然界的基因转移和璽组自然界不同物种或个体Z间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变界和物种演变、进化的基础。基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。1.接合作用(Conjugation)当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)o2.转化与转导作用(1)转化作用(Transformation):由外源性D

2、NA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。(2)转导作川(Transduction):当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另-一(受体)细胞时，发牛在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。3.转座(转位)(Transposition)可移动的DNA序列包括插入序列和转座了。故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。可分为插入序列(insertionsequenceTS)转座和转座予(transposons)转座。4.基因重组不同DN

3、A分子间发生的共价连接称基因重组。基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespocialrecombination)和同源重组(homologousrecombination)。二、重组DNA技术'1.重组DNA技术的相关概念(1)D7A克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的和同的集合。DNA克隆(DNAclone)：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有白我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有冃的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分了的过程。DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。DNA克降也指将DNA重

4、组体引进受体细胞中,建立无性系的过程。因此，又称为基因克隆(genecloning)＞基因工程(gentreengneering)重组DNA技术。(2)1具酶；常用的有：内切酶、连接酶、聚合酶1、反转录酶等。在所有工具酶小以限制性内切核酸廨最重要。限制性内切核酸»(Restrictionendonuclease)是指能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据组成和作川特性的不同，常用的限制性核酸内切酶可分为三类。，重组DNA技术川到的为II类。其特点为：①具有识别特界性：识别DNA分子上特定的核昔酸序列，该序列一般呈回文结构(Pal

5、indrome),如：E.CoRI识别的序列为5’GAATTC3'。②具有切割特异性:从某一特定位点或其周用切割，产生麻产生粘性木端或钝性末端，如：E.CoRI从G和A之间切开，产牛两个粘性本端(5‘GtAATTC39o不同的限制性内切核酸酚识别DNA中的核背酸长短不一，切割位点的多少也不同，产生的片段大小各界(3)目的基因：U的基因(targetgene)是我们要研究或利用的DNA序列或基因，称为日的基因。口的DNA有两种类型：cDNA和基因组DNA。cDNA(ComplementaryDNA)是以RA为模板，经反转录合成的与RXA互补的单链DNAo以cDNA为

6、模板经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA(genomicDNA)是指代表一个细胞或牛物体整套遗传信息的所有DNA序列。(4)基因载体：也叫克载隆体(cloningvector)是携带目的基因，实现目的基因的无性繁殖或表达冇意义的蛋白质所采用的一些DNA分了。具冇转录和翻译所必须的DNA序列，可以完成1=1的基因表达过程的载载体称为表达载体(expressionvector)。作为载体，必须要有独立的复制能力，可导入宿主细胞，并且要便于检测。常用的载体有质粒DNA、噬菌体DNA.和病DNAo质粒(Plasmid)是存在于细菌染色体以外的环状DNA分子。质粒人小适

7、宜，拷贝数多，易于转化，利于筛选，有理想的酶切位点。噬菌体(phage)是侵袭细菌的病毒。常见的噬菌体冇九噬菌体和M13噬菌体。棊因工程所使用的噬菌体DNA均是经过人工改造的。M13噬菌体的基因I'可隔区插入E.Coli的调节基因及LacZN—端146个竝残基编码基因，其产物为半乳糖背酶的皆片段。而突变型Lac-EColi可表达卩-半乳糖昔陆的(0-片段(酚的C-端)，单独的or片段及3-片段均无B-半乳糖昔酶的活性。当舍有LacZ的M13噬菌体转化Lac-E.coli细菌时，or片段及片段共同表达，宿主Lac—E・COli细菌才有［3-半乳糖井酶活性，使特异的