第5讲酶的生物合成法生产

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1、第三章酶的生物合成法生产第一节产酶细胞的选择一、酶源•酶可由动物(如胰蛋白酶、胃蛋白酶)、植物(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶)和微生物(细菌、霉菌、酵母)产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。•由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。•产酶微生物的获得：1、从有关菌种保藏机构购买2、从自然界分离筛选国内一些比较著名的菌种保藏机构•ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心•ISF中国农业科学院土壤肥料研究所•CAF中国林业科学院菌种保藏管理中心•CICC

2、工业微生物菌种保藏管理中心•IFFI轻工业部食品发酵工业科学研究所•CMCC医学微生物菌种保藏管理中心•CVCC兽医微生物菌种保藏管理中心•YM云南省微生物研究所•GIMCC广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心•CCTCC中国典型培养物保藏中心，武汉大学•HKUCC香港大学保藏中心，香港大学•台湾新竹BCRC(BiorcsourccsCollectionandResearchCenter)台湾生物资源保存及研究中心(食品工业发展研究所)国外一些比较著名的菌种保藏机构•ATCC(AmericanTypeCulture

3、Collection)•NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美国农业部菌种保藏中心。•DSMZ(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)•NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)H本技术评价研究所生物资源中心，NBRC(IFO)是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。•JCM(JapanCollectionofMicroorganisms)•VKM(

4、All-RussianCollectionofMicroorganisms)•CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures荷兰真菌中心收藏所)•UKNCC(UnitedKingdomNationalCultureCollection)•NCIMB(NationalCollectionsofIndustrial,foodandMarineBacteria)英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心2、从自然界中分离筛选产酶微生物•从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离筛选。•1克土

5、壤中含有IX10*个微生物，自然界蕴藏着巨大的微生物资源。•从不可培养微生物中筛选新酶种。用PCR技术从土样中直接扩增DNA,能够从不可培养的微生物中分离到DNA,并用作克隆来源，可获得更多种类的酶。从极端环境微生物筛选新酶种•嗜热微生物(Thermophiles60・85°C,超嗜热菌生长温度85°C以上,105°C)。•嗜冷微生物(Psychrophiles・10〜0°C)•嗜盐微生物(Halophiles,含盐32%或5.2%)•嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5)•嗜碱微生物(Alkalophi

6、les,pHll)•嗜压微生物(Barophilcs,1.01X105Pa,4X107Pa)•重视微生物资源、基因文库、基因表达载体等方面的建设，以及极端环境微生物，不可分离微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。产酶微生物的分离筛选方法•1）样品的采集：从富含该酶作用底物的场所采集样品。•2）富集培养：投其所好，取其所抗。•3）分离获得纯培养（pureculture）的微生物。•4）初筛：选出产酶菌种，以多为主。•5）复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。培养基•细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH7.0

7、,30-37°C）•霉菌：可用察氏、土豆（PDA）、麦汁琼脂培养基（pH5・5,25・28°C,为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可加入0.1%去氧胆酸钠、（H%山梨糖等限制菌落扩散）。•放线菌：高氏培养基、甘油精氨酸培养基等（pH6.8-7.0）o•酵母：用麦汁琼脂培养基（pH4.5-5.5）o添加药物抑制非目标微生物生长•为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的药剂以抑制干扰微生物的生长。•如为了抑制霉菌的生长，可加入30-50U/ml制霉菌素、克念霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。•为了

8、抑制细菌的生长，可添加青霉素（30U/ml）、四环素、猛加拉红（0.001%）,不干扰霉菌的生长。•为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（50mg/inl）或纳他霉素，不影响细菌的生长。选择性培养基•用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物；•用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物；•用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的微生物；•在高温下培