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《实验设计-骨髓基质细胞系的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、小鼠骨髄细胞群细胞系的建立一、实验目的：1)通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系2)了解细胞培养的一•般步骤和注意事项，培养无菌操作意识二、实验原理：细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理，将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中,部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋口酶的
2、耐受性不同，成纤维细胞先脱壁,利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的口的三、材料：实验小白鼠四、药剂及配制：DMEM培养基购买血清购买8.00KC10.40D-Hank's溶Na2HPO4・2H,O0.06液(g/L)kh2po40.06NaHCO.0.35酚红0.0275%酒精星取无水酒精"5份定容至1000.9%生理衲水称取9gXaCl溶于少長无菌水,定容至1L乙醯NaHCO5淮确称聖正5g溶解于100ml三蒸水，过滤除菌，分装后彳C保存。胰蛋白酶滝：根据原代细胞的贴壁程度配宣
3、，可选008%、0.125%、025%,用長为lml/cm2,2ml/75cm2,37t作用数分聊。【例：淮确称取胰蛋白酶粉末025g,用pH为8-9的D・Hank‘s液溶無，定容至100ml;震荡过夜；过滤（022pm滤膜）除菌，分装；用之前用NaHCO3调节pH至7.2左右。-20=C保存】EDTA逵确称取EDTA0.02g,用D・Hank‘s液溶禅后定容至10X11,高温高压灭菌，分装。・20匕保存。双抗溶液青尊素：O.OO7-O.OO8g/100ml；链霉素:O.Olg/lOQml;用时加在培养基里4%
4、台盼蓝取4g台盼蓝，用0.9%生理稱水定容至100ml,过滤，彳C保存DMSO五、仪器器材：（1）培养皿X3、500ml烧杯XI、棉花、医用解剖器材（剪刀、铁子、解剖刀）、10ml注射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、汕性笔、冻存管（2）超净工作台、CO2培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、・86°C冰箱第一部分实验前准备1.（新）玻璃器皿的清洗•后5%的盐酸溶液浸迪过孜刷洗•冃足童的決衣粉反复刚洗，将瓶壁上的残淒
5、洗二净•将千燥旨的器皿年童络酸芸溶液（重络B^120g:浓硫酸200ml:蒸輕水[Mr冲洗I1L）浸泡过夜将浸酸石的玻璃器皿用自来*冲;知然后弓養请水‘最后千煥、待用2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌（1）超净工作台检查超净工作台是否正常;用Z前用沾了75%洒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射（2）小件物品川牛皮纸（报纸）将小件物品（如锻子、解剖刀等）包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内,95KPa、12rCH灭菌30min（3）其他仪器灭菌3、试剂配制（如上表）4、器材准备5、注
6、意：1）使用高压火菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险2）超净丁作室和T作台必须清理干净，以免引起细胞污染浸泡•用5%的盐酸溶液浸泡过夜刷洗•用足量的洗衣粉反复刷洗，将瓶壁上的残渍洗干净浸酸•将干燥后的器IIIL用重络酸钾溶液（重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸锚水1L）浸泡过夜冲洗•将浸酸后的玻璃器皿用口来水冲洗,然后用蒸憎水，最后干燥、待用第二部分原代培养器材：解剖刀、剪刀、蹑子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管X4、培养瓶X2,冰块试剂：乙醴、D-Hankys溶液、生理盐水仪器：超净工
7、作台、离心机、显微镜步骤：1.取样1）超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、铁子、注射器、平皿、冰块2）将小鼠川乙瞇麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒梢的烧杯中浸泡5mino在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃平1111中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。3）剪去肪端。用10mL注射器抽収食量D-Hank,s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。4）用4号针头反复吹打骨髄细胞悬液，制成单细胞悬液,，盛在离心管里。5）将悬液在1000r/min下离心5min后收集细
8、胞2.原代培养1）収出部分细胞用显微镜计数【附:血球计数板计数法】2）以1X108/ml细胞密度接种在25cm2卡式瓶中，加血清培养基3）在饱和湿度F5%CO237°C恒温培养箱中培养。3、注意：1）超净工作台上操作的基木规范；2）离心机的使用方法；第三部分传代培养器材：卡式瓶若干、滴管、洗耳球、移液管试剂：D-Hank,s液、胰蛋白酶液、EDTA液材料：生长良好的原代培养细胞步骤：1
