细胞鞭毛染色法及活菌活动性观察_山东大学

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1、细胞鞭毛染色法及活菌活动性观察【实验目的】1.学习压滴法观察细菌活细胞的运动性；2.了解细菌鞭毛染色的原理，常握鞭毛染色的方法，并了解鞭毛的形态特征；3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。【实验原理】1.压滴法观察活菌运动的基本原理压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置于显微镜下观察。细菌未染色时无色透明,在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。若想观察的更加清晰，可以滴加稀释美兰等染液进行染色，但稀释美兰的滴加对活菌的生长产生较大的影响，因此一般通常选用不进行染色直接观察的

2、方法。有鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。2.细菌鞭毛染色法的基本原理鞭毛在某些细菌菌体上具有细长而弯曲的丝状物，称为鞭毛。鞭毛的长度常超过菌体若干倍。在某些菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，少则1-2根，多则可达数百根。这些丝状物称为鞭毛，是细菌的运动器官。简单染色法适用于一般的微生物菌体的染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如鞭毛，对它们进行观察之前需要进行有针对性的染色。鞭毛是细菌的纤细丝状的运动器。鞭毛的有无、

3、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10^30nm,只有用电镜才可以直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用硝酸银进行染色。染色完成后可在光学显微镜下观察到细菌的鞭毛。【实验器材】1、菌种：枯草芽葩杆菌（周生鞭毛），铜绿假单胞菌（端生鞭毛）2、溶液和试剂：质量分数为95%的乙醇溶液，蒸锚水，硝酸银染液A液和B液等3、仪器及其它用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧

4、杯,试管架，载玻片夹子，滴管和滤纸等。【操作步骤】A.压滴法观察活菌运动简单流程图：•㈠洗片'•㈡涂片丿・㈢滴加稀释美兰、•㈣加盖玻片丿•的迅速镜检（暗光）丿详细过程：1）洗片用自來水和去污粉将载玻片清洗干净（注意：不要用刷子刷，以免划载玻片），最后用蒸傳水冲洗，后放入盛有95%的乙醇中浸泡5min,用夹子夹持载玻片在火上烤，使酒精烧掉，载玻片干燥；2）涂片在载玻片的一端滴加一滴蒸憎水，釆用无菌操作将所要观察的菌种接种到水滴中少许（稍显浑浊即可），涂片完成；3）加盖玻片加盖玻片时首先使盖玻片的一端接触载玻

5、片上的液滴的一端，然后再将另一端缓缓放下，冃的是防止气泡的产生，以免影响观察；4）迅速镜检（暗光）由于菌体是放在蒸僧水屮的，所以装片做好后要迅速镜检，以取得最佳的观察效果。镜检的过程与前一实验相似，先用低倍镜找到合适的视野范围，然后再换用高倍镜观察，注意在观察运动时要观察有相对运动的细菌，通常应该选取暗光，以增加细菌与水的对比度。B.细菌鞭毛染色简单流程图：⑸滴加硝酸银A液（3~5min）⑻水洗⑼口然干燥（10）镜检（从多到少）详细过程：a）洗片用自来水和去污粉将载玻片清洗干净，然后用蒸憾水冲洗，接着将洗

6、好的载玻片放入盛有95%的乙醇溶液的培养皿中，浸泡5min后取出，用火烤干。其目的是将载玻片上的油污等洗掉；b）涂片在载玻片的一端中央滴加一滴，采用无菌操作将所要观察的菌种移动到水滴中少许（注意：不可搅拌,以免将鞭毛折断），将载玻片倾斜使液滴从载玻片的一端流到另一端，然后用吸水纸吸取多余的液滴,涂片完成；c）自然干燥干燥前先对载玻片正反面进行标记；d）滴加硝酸银A液向涂片上滴加适量的硝酸银A液，覆盖约5分钟；e）水洗将上一步中所滴加的硝酸银A液洗掉，注意冲载玻片背面，防止将涂片中的菌种冲掉；f）硝酸银B液

7、冲洗用硝酸银B液冲洗涂片，覆盖1分钟左右，且用酒精灯稍稍加热；g）水洗h）自然干燥i）镜检将做好的涂片放到显微镜下，由多到少观察细菌，以方便找到鞭毛，观察吋应不断移动视野范围，先找到细菌，再仔细观察细菌周围经过染色的鞭毛（注：枯草杆菌的菌体较大，为周生鞭毛，较难观察,也可能会出现侧生鞭毛的现象，这是因为鞭毛断掉；铜绿假单胞菌菌体较小，为端生鞭毛，较容易观察）。【实验结果与分析】A.实验图示铜绿假单胞菌枯草芽胞杆菌B.实验结果分析通过本次鞭毛染色实验，我认识到，以下儿个方面决定了鞭毛染色是否成功。1.染色用

8、玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。2.菌种的菌龄。老龄的菌种的鞭毛极易脱落，因此染色后很难看见有鞭毛。可以选择菌落边缘的幼龄菌落。3.在盖玻片上接种的时候，只需要在水屮轻轻地沾儿下即可，不要用里过猛，更不能用接种环大幅涂开。若动作太重太大，菌种的鞭毛就会被刮落。4.银染剂的使用方式和吋间很重要。若吋I'可过短或方式不当，就很难在媒染剂上着色，那么，我们也就没有办法在显微镜下观察到鞭毛了。5.鞭毛染色的玻片最好是口然晾干。