实验四 鞭毛染色法及活

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1、模块二实验四鞭毛染色法及活细菌的运动性观察一实验目的学习细菌的鞭毛染色法及细菌运动性观察方法二实验原理细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果只需

2、查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动性，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。鞭毛三实验器材1菌种：培养12-

3、16小时的变形杆菌或大肠杆菌斜面。2染色液与试剂：鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液。3器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、镊子、接种环，显微镜。运动性观察1菌种：培养12-16h的变形杆菌和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）。2试剂：香柏油、显微镜擦拭液、凡士林等。3器材：凹玻片、载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。四实验方法1清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠。应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮

4、沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5～6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95％乙醇中脱水。2菌种的准备及制片：菌龄较老的细菌容易脱落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3～5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12-16h。然后，吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，无菌操作在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端

5、。用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。3染色1）滴加A液，染4～6min。2）用蒸馏水充分洗净A液。3）用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5～lmin(加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸)。4)用蒸馏水洗，自然干燥。4镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。运动性观察1制备菌液。在幼龄菌斜面上，滴加3～4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。2涂凡士林。取洁净无油的盖玻片一块，在其四周涂少量的凡士林。3滴加菌液。加1滴菌液于盖玻片的中央

6、，并用记号笔在菌液的边缘做记号、以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。4盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上．使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。若制水浸片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。5镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的．镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运

7、动还是分子运动即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至它处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。四实验报告绘出细菌鞭毛的形态及着生位置绘出所看到的细菌的形态图，并注明表示其运动性。五注意事顶1检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油。否则将影响细菌的运动。2制水浸片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。3若使用油镜观察，可在盖玻片上加香柏油一滴。