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《细胞工程实验诱导细胞融合》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、诱导细胞融合——聚乙二醇法实验目的：了解细胞融介的原理，初步掌握用PEG诱导细胞融介的方法。实验原理：细胞融合，即在自然条件下或利用人工法(生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具冇双核或多核细胞的过程。人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应川于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。聚乙二醇(PEG)结构为：H0H2C(CH20CH2)n
2、CH20H,相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和匝组，山于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融介：细胞融介率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所冇细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。实验材料用品：材料：蟾蛛血红细胞，鸡血红细胞。试剂：(l)Alsver液：制萄糖2.05g
3、,柠檬酸钠0.8g,氯化钠0.42g,用柠檬酸溶液调节pH值至7.2,最后用重蒸水定容至100mL即可。(2)0.85%生理盐水：0.85g氯化钠溶于100mL重蒸水中。(3)GKN液:氯化钠8g,氯化钾0.4g,磷酸氢二钠1.77g,磷酸二氢钠0.69g,葡萄糖2g,酚红0.01g,溶于lOOOmL重蒸水中。(4)Ringer溶液：氯化钙0.25g,氯化钾0.42g,氯化钠6.5g(恒温动物8.5g)溶于lOOOmL蒸惚水中。(5)氯化鈣0.14g,氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.06g,氯化镁0.10g
4、,氯化钠8.0g,碳酸氢钠0.35g,七水磷酸氢二钠0.09g,D-葡萄糖1.0g,酚红O.Olg⑹50%PEG混合液：称取少许PEG(Mw4000)放人刻度离心管内，在沸水浴屮加热，使其溶化，待冷却至50°C时，加入预热至50°C的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制。仪器：显微镜，离心机，水浴箱，电炉，屋筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯，吸管，载玻片,盖玻片，显微镜。实验步骤：1.细胞悬液的制备：(1)蟾蛉血红细胞悬液的制备：用注射器吸入ImLAlsver液后,从蟾蛉主动脉弓取AlmL放入刻度
5、试管中，再加入2mLAlsver液(封口后可4°C冰箱内可保存1周);放入刻度离心管内,按照3：1(V/V)加入6mLAlsver液混匀，放入4°C冰箱内可保存3--4天。(2)鸡血红细胞悬液的制备：用注射器吸入ImLAlsver液后从鸡翼下静脉収鸡血2mL,注入刻度离心管内，按照3：1(V/V)加入6讥Alsver液混匀，放入4°C冰箱内可保存3—4天。(主动脉弓取血前处理方法)3.弃上清液（用吸管吸去）,加0.85%生理盐水至5mL,混匀后1500r/min离心5min。4.重复上述条件，再离心洗涤1
6、次。5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量的GKN液或Ringer溶液，按压积红细胞体枳配成10%的红细胞悬液。6.取悬液ImL到1个试管中,加入0.5〜0.8mL预热的50%PEG混匀,置于37°C水浴中温浴2min；再加入Ringer或Hanks液5m1以终止PEG的作用;取血细胞悬液1滴滴于载玻片上，再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴,盖上盖玻片。7.利用光学显微镜或倒置显微镜（高倍）观察2个靠近细胞或3个细胞形成融合的过程。8.进行多个视野的测定，统计平均融合率。实验结果：作业：1、绘制观察到的细
7、胞融合图。2、计算观察到的细胞融合率。注意事项：如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行灭菌，采血在无菌条件下进行诱导细胞融合——电场法实验目的：木实验学习掌握电场法诱导细胞融介的方法。实验原理：电融合技术的原理是：在短时间强电场(高压脉冲电场，场强为kV/cm量级，脉冲宽度为卜级)的作川下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接轴区时，即可诱导它们的膜相互融合，导致细胞融合。该方法具彳j直观、定向、高效的优点。实验材料用品：材料：
8、小麦叶片原生质体，烟草叶片原生质体。(原生质体的茯得可参照实验九)试剂:1%(W/V)纤维索酶，1%(W/V)果胶酶,0.7mol/L甘露醇:10mmol/LCaC12.2II20,0.7mmol/LKH2P04,pH6.8〜7.0。用具：离心机，振荡器，电融合仪，细胞融合池。实验步骤：1、将制备原生质体悬液以1000r/min离心5min,用超纯水配制的0・6M甘露醇清洗，重复两次。2、吸去上清夜，再用0.6M甘露醇将细胞密
