《EG诱导细胞融合》PPT课件

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1、PEG诱导细胞融合李卓王慧琴杨佳慧王钟秀细胞融合自发条件下或人工诱导下，两个或两个以上的同种基因型或异种基因型的细胞融合成一个细胞的过程称为细胞融合，也称细胞杂交。同种细胞能够自发融合，是机体重要的生命活动，如有性生殖时配子的融合。异种细胞的融合必须经过诱导剂处理，进行诱发融合。细胞融合技术是指细胞通过诱导和培养，在离体条件下用人工方法使不同种细胞发生膜融合、胞质融合和核融合从而形成杂种细胞，使其同时具有两种细胞的遗传和生物特性。常用的人工诱导方法包括：病毒诱导法、电刺激法、聚乙二醇诱导法。细胞融合发展史自然发生的细胞融合

2、早在19世纪人们就发现在自然条件下生物界中有自发的细胞融合现象。Muller1838年在肿瘤中观察到了多核细胞此后在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的扁桃体中陆续发现多核细胞这些多核细胞可能是病毒作用的结果：但当时还没有人认识到这一点。1875年Lange首先观察到脊椎动物蛙类血液细胞合并，继之又有一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合细胞。2.PEG作为促融剂引起的革命、由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,科学家们又尝试寻找比病毒简便、快速和高效

3、且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学PEG加拿大华裔科学家高国楠等(1974年)的研究取得重大突破他发现高分子量的聚乙二醇(PEG)在Ca2+存在时能促使植物原生质体融合显著提高融合率从而迅速推动了原生质体技术的基础研究和应用研究。至此应用原生质体和发展操纵它们的方法已引起实验生物学的“无声革命”。,同时,Pontecorvo(1975年)发现PEG能诱导哺乳动物细胞融合并产生杂交细胞。1976年Davidson等对此作了进一步证实。以后的研究工作表明,PEG不仅可以促使植物、动物、微生物的细胞融合,而且还能促

4、使动物细胞与植物的原生质体发生融合,促使微生物原生质体与动物细胞融合,使植物原生质体摄入微生物。1975年Ahkono报道用PEG将母鸡的红血球细胞和酵母菌的原生质体融合成功1976年Dudus等报道人的细胞能和胡萝卜的原生质体发生融合。Davey(1972年)和Vasil(1977年)用植物原生质体摄取了细菌细胞。1975年，在动物体细胞杂交技术的基础上又创立了淋巴细胞杂交瘤技术。同体细胞融合一样,杂交瘤工作早期使用的促融剂——灭活的仙台病毒,已逐渐为化学促融剂PEG所取代。Davidson等于1976年建立的以PEG诱

5、发哺乳类细胞融合的方法,也同样适用于淋巴细胞同瘤细胞的融合。由于淋巴细胞杂交瘤技术能制备纯度高、专一性强的抗体,适于由未纯化的抗原大量制备,因而在短短几年时间里,即已被广泛用于制备各种单克隆抗体。PEG诱导细胞融合PEG作用机制聚乙二醇（PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG是一种特殊的脱水剂，可与水借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，使细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合

6、并在一起，使细胞的胞质沟通，从而造成相互接触的细胞之间发生融合。PEG的最适使用条件细胞的融合效果与PEG的相对分子质量及其体积分数成正比，但PEG的相对分子质量越大、体积分数越高，对细胞的毒性也就越大。实验时常选用PEG相对分子质量为4000-6000，体积分数为50%时，细胞破碎较少，融合率较高。其他影响细胞融合的因素钙离子可以使带微弱负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，引起细胞膜表面电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个细胞全部融合。当钙离子浓度

7、为50mmol/ml时，融合效果最好。实验结果：观察到两个或多个细胞发生质膜融合但核尚未融合，有的则是细胞间不仅发生质膜融合，而且细胞核也发生了融合。刚开始融合开始进行核融合分析讨论聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，使细胞发生融合，形成融合细胞。本次实验用聚乙二醇处理鸡红血细胞并制片利用显微镜观察。由实验结果可得，鸡血红细胞两个或者更多出现不同程度的相互融合，但总体来说融合率还是不错的。经分析主要是以下原因：由于PEG与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜，PEG与鸡血红细胞充分

8、接触，从而融合率比较高。实验注意事项：1.由于离心时红细胞的数量很少，吸取的时候要小心，尽量把吸附在管壁上的红细胞都吸出来。此外吸取的动作不能太大，否则会破坏离心形成的分层。2.PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否则会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或者细胞膜破裂导致细胞质外泄。3.经PE