细胞生物学实验技术（一)

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1、动物细胞生物学实验技术主要内容第一节培养细胞的细胞生物学第二节细胞培养第三节显微镜知识第四节细胞生物学实验技术第一节培养细胞的细胞生物学主要内容（一）体内、外细胞的差异（二）体外培养细胞的分型（三）培养细胞的生长和增殖过程体外培养的细胞和体内细胞的比较相似：仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止细胞相互沟通生物信息的结果对细胞外基质仍有依存性差异：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不明显细胞外基质存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性成分(胶原蛋白、

2、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。1．影响细胞的存活、生长与死亡正常真核细胞，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为定着依赖性（anchoragedependence）。例如，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡。2．决定细胞的形状细胞呈单个游离状态时多呈球形。同一种细胞在不同的细胞外基质上粘附时可表现出完全不同的形状。细胞外基质决定细胞的形状这一作用是通过其受体影响细胞骨

3、架的组装而实现的。3．控制细胞的分化细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。例如，成肌细胞在纤粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增殖，进行分化，融合为肌管。4．参与细胞的迁移细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，并为细胞迁移提供“脚手架”。细胞的迁移依赖于细胞的粘附与细胞骨架的组装。细胞粘附于一定的细胞外基质时诱导粘着斑的形成，粘着斑是联系细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。（一）体内、外细胞的差异体内：神经和体液的调节、细胞间相互影响体外：缺乏动态平衡的稳定环境发生的变化分化现象减弱形态功能趋于单一化一定时间后死亡或者转化获得不死性体外培养的细胞仍具有研究

4、的意义许多性状仍与体内相同如体外培养的心肌细胞仍可博动，细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭／开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。（二）体外培养细胞的分型贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按体内组织学标推判定悬浮型：见于少数特殊的细胞，白血病细胞，骨髓细胞或免疫细胞，不需要细胞间和细胞与培养表面的接触。贴附型细胞的分类成纤维细胞型上皮型细胞游走细胞型多型细胞型成纤维细胞型梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状

5、态。凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。上皮型细胞：扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动，细胞很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。游走细胞型：散在生长，不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。（三）培养细胞的生长和增殖过程培养细胞的生命周期是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。种类、供体的年龄等。人胚成纤维细胞可传30～50代，约150～300个增殖周期，能维待一年左右，最后

6、衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纤维细胞仅可传几代供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。生命周期的三个阶段原代培养期传代期衰退期原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养到第一次传代。原代培养（PrimaryCulture）期原代培养细胞与体内原组织细胞在形态结构和功能上相似性大。特点细胞群是异质的（Heterogeneous）细胞克隆形成率（CloningEfficiency）低，即细胞独立生存性差。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检

7、测药物很好的实验对象原代培养分为两种方法直接接种组织块由组织分离出细胞后接种组织块接种：牛胎儿成纤维细胞传代期：原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。衰退期：增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。少数情况下，细胞可能发生自发转化（Sponta