胚胎学进展与系统发生

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1、诱导胚胎干细胞向神经细胞分化方法的研究与探讨年级：2010级医学检验姓名：张毅强学号：2010223306摘要：胚胎干细胞(Es细胞)是一种能够在体外进行不断自我更新，并具有多种分化潜能的细胞。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展迅速，相关实验技术和理论也不断发展。总结了近年来各国研究者诱导小鼠和人胚胎千细胞向神经细胞分化的方法，分析了一些方法的原理并初步探讨其相关的分子机制，并提出一些可行性新方法。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化因其体外的可操作性、来源的广泛性及质量可控性将有可能成为临床上治疗神经系统疾病的有效方法。关键词：胚胎干细胞；诱导分

2、化；神经细胞哺乳动物的胚胎干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)研究近年来已取得了较大进展，人类胚胎干细胞(hES细胞)的研究起步较晚，但在无数哺乳动物尤其是鼠类ES细胞的培养和诱导分化的方法上已获得很多成功经验。胚胎干细胞理论上可以分化为体内任何一种细胞，体外大量繁殖可为细胞移植提供足够的来源，因此利用ES细胞进行细胞移植的研究近年来已成为研究热点，体外定向诱导干细胞分化为特异性细胞或其前体，再植入受者体内，可达到修复损伤、治疗疾病的目的。神经系统一直被认为再生能力有限，尤其是成体神经元不再分裂，这大大影响了神经系统疾病患者

3、的康复，因此体外诱导ES细胞产生神经细胞，以治疗神经系统疾病的研究更加有意义。本文着重对各国学者体外诱导ES细胞产生神经细胞的实验方法做一总结，并初步探讨了其中的分子机制。方法大致分为两大类：基因外诱导(epigeneticmanipulation)和基因修饰(geneticmethods)。l基因外诱导在基因外即细胞水平对ES细胞进行诱导分化，包括使用特异性诱导剂、序贯诱导法，还有目前尚有争议的特殊诱导方法。各种方式各有优势，其诱导效率也不尽相同，但因其操作相对简单、对实验室要求不高，为大多数研究者所采用。现分述如下。1．1特异性诱导剂——维

4、甲酸最常用于诱导神经细胞分化的物质是维甲酸(retinoicacid，RA)，它已被证实是一类促神经生长因子，不仅对多潜能干细胞有神经诱导作用，对分化末期的神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。它的优点在于只要向已开始分化的ES细胞培养液中添加一定剂量的RA【l，2，3】甚至在未分化的ES细胞中直接添加RA【4】，就可以获得大比例的神经细胞，它所需时间短、成本低，是使用广泛的神经诱导方式。1．2序贯诱导法序贯诱导法是模仿体内胚胎细胞生长、分化环境，按ES细胞生长阶段逐步改变培养液成分、血清浓度，添加生长因子、神经营养因子等，诱导ES细胞定向神经

5、分化。该方法操作简单、细胞毒性小，而且产生的神经元纯度较高。1．2．1经典“五步法”Lee等【9】使用“五步法”诱导mES向神经细胞诱导分化：第一步扩增未分化的胚胎干细胞；第二步去除促有丝分裂素或分化抑制剂，ES细胞开始分化，不贴壁悬浮生长，逐渐形成类似体内发育的胚体(EBs)；第三步去除生长因子，选择巢蛋白(nestin)阳性细胞(即神经前体细胞)：第四步使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞：第五步利用促神经元存活因子(SPF)诱导并维持神经元成熟。共耗时31天左右，得到72％神经元样细胞。Zhang等人将该方法用

6、于人类胚胎干细胞，细胞在无饲养层、无血清、含有碱性成纤维细胞生长因子(FGF．2)的神经细胞培养液(含多种神经营养因子)中生长-10天，观察到有神经管样的玫瑰花形结构(rosette)产生，免疫荧光法证实其中72％一84％的细胞为神经上皮细胞，有(96±0．6)％的细胞表达nestin，这些神经前体细胞可自我增殖，去除FGF．2可进一步分化产生神经元(多为谷氨酸能神经元)、胶质细胞和少突胶质细胞。1．2．2直接分化有报道让hES细胞在未更换的饲养层细胞上高密度延长培养3周，细胞集落中没有出现明显的拟胚体结构，在接下来的神经细胞培养液中hES细胞

7、能自发分化为神经样细胞，经免疫细胞化学法证实为原始神经上皮。分离出的这些神经前体细胞既可以在EGF、bFGF的作用下繁殖，又能够自发进行分化，表达成熟神经元的特异性抗原1151。Reubinoff等人继续深入该实验，使用无血清神经细胞培养液让hES细胞过度生长，在细胞集落中央获得了高纯度的原始神经上皮，通过进一步诱导得到大量神经细胞，并成功移植入新生鼠的大脑内，分化为各种神经细胞【M】。这种直接分化法的应用不仅免去了反复培养饲养层细胞，减少了换液、细胞传代的次数，并且可产生高纯度的神经前体细胞，值得尝试并推广。只是其中涉及到的分子机制尚不清楚，

8、与现有的神经细胞分化理论相矛盾，有假说认为是通过与TGF．p相关的内定神经细胞分化模式起作用，还有待于进一步研究证明。1．3其他诱导方法1．3．1基质