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1、细胞剪切力实验--FOXC2和流体剪切力在后天淋巴管系统形成中的重要作用生物体内存在的机械力，比如流体剪切力对内皮细胞有着非常多的影响。在血管中，不规则的乱流通常和血管的疾病（比如，动脉粥样硬化）是相关的，并且能直接影响内皮细胞的分化和凋亡。因此，2015年，瑞士的一个研究小组在淋巴管中研究不规则的剪切力的作用中发现，不规则的剪切力和转录因子FOXC2共同在在淋巴管形成中有着非常关键的作用。在体外培养的淋巴管内皮细胞中，FOXC2受到振荡剪切力的刺激会高表达，并且增强细胞间的联系，降低细胞的增殖率；而FOXC2的失活会使细胞对不规则的剪切力敏感，使细胞连
2、接分解并且促进细胞增值。文中，研究人员选择4dyn/cm2每4秒变换流向的振荡流（OSS，oscillatoryshearstress)来模拟体内不规则的乱流。FOXC2andfluidshearstressstabilizepostnatallymphaticvasculatureA.Sabine,E.Bovay,C.S.Demir,W.Kimura,M.Jaquet,Y.Agalarov,N.Zangger,J.P.Scallan,W.Graber,E.Gulpinar,B.R.Kwak,T.Mäkinen,I.Martinez-Corral,S.O
3、rtega,M.Delorenzi,F.Kiefer,M.J.Davis,V.Djonov,N.MiuraandT.V.PetrovaTheJournalofClinicalInvestigation,2015,10.1172/JCI80454一、实验准备实验材料及设备1）细胞：lymphaticendothelialcells(LECs)2）抗体：FOXC2（大鼠抗人/小鼠，由Dr.N.Miura赠送，Miuraetal,1997,Genomics）VE-cadherin(山羊抗人/小鼠，R&D（#AF1002））Ki67(兔抗人/小鼠，Abcam（#
4、ab15580）二抗（Alexa488-conjugated，Alexa555-conjugate，Alexa647-conjugated，LifeTechnologies）3）培养耗材：ibidi单通道载玻片μ-SlideI0.8Luer（ibidi，Germany，80196）灌流管，15cm，1.6mm直径（ibidi，Germany，10962）封口夹4）仪器设备：ibidi流体剪切力系统，含空气泵（ibidi，Germany，10905）和流体单元（ibidi，Germany，10903）二、实验方法在实验开始前一天，请将所有需要使用的试剂，培
5、养基，通道载玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培养箱中放置过夜，排除由于温度差产生的微量气泡。按照下面流程铺细胞：1）将LECs细胞悬液加入通道载玻片中，注意，将移液器头插入注液孔中再加入细胞悬液，可以轻微倾斜通道载玻片帮助细胞悬液充满整个通道（图一）。图一：铺细胞，将枪头插入注液孔中再打入细胞悬液。2）盖上注液孔盖，将通道载玻片放入细胞培养箱中培养半小时，等待细胞贴壁。细胞贴壁后，拿出通道载玻片，在每个注液孔中分别加入60μl培养基，注意，枪头要悬在孔上方滴入培养基（图二）图二：在注液孔中分别滴入60μl培养基。1）将通道载玻片再放入二氧化碳培养箱进行培
6、养24小时左右，等到细胞刚刚长满为单细胞层，即可开始实验。注意，要使用单层细胞进行剪切力实验，使每个细胞均受到均匀的剪切力。2）静置条件下细胞培养。在通道载玻片中静置培养的细胞可以作为流体剪切力条件下培养的细胞对照。待流体实验开始的同时，将静置细胞培养的对照组放入二氧化碳培养箱中进行2天的培养。注意，培养过程中每天都要更换培养基。二）搭建流体系统1）将灌流管按照说明放在置在流体单元上。在灌流管的储液管中加入12ml培养基。这时不需要连接通道载玻片。实验前需要去除整个灌流管中的气泡，存留在灌流系统的气泡会影响剪切力的大小，有时还会使灌流系统中的液体流动停滞
7、。打开ibidi泵控制系统，在任务栏中找到“Removeairbubbles”，ibidi流体剪切力系统将自动运行下面任务，用于去除气泡。（表一）压力剪切力流速持续时间1）50mbarNone（noslide)23.4ml/min不限2）连接通道载玻片。去除气泡后，就可以将之前准备好的含贴壁细胞的通道载玻片与灌流管相连。将搭载灌流管的流体单元从流体剪切力系统中取下，放到超净台中。将通道载玻片的注液孔用培养基装至过满状态(）。之后就按照下面的流程图连接通道载玻片（图四）。图四：a）封口夹轻轻将灌流管的硅胶管夹住。b）将其中一个鲁尔接头从中间的链接管中拔出。
8、c-j）按图示，将鲁尔接头与通道载玻片的注液孔相连，注意不能产生气泡，会有部分培
