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时间:2019-08-08
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1、如何提高PCR产物克隆的效率作者:佚名 实验频道来源:生物通 点击数: 更新时间:2004-6-12把PCR产物克隆到载体上常见有3种做法:1.直接克隆到T载体(或者U载体上)2.引物设计时引入酶切位点,PCR产物酶切后直接克隆到目标载体上3.将平末端PCR产物直接克隆到平末端酶切载体上。 方法3主要是针对高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶,NewEnglandBiolabs公司的Vent酶,以及QIAGEN公司新出的同时具有热启动功能的高保真ProofStart酶,进行PCR扩增,由于这类酶有很强的校读功能,能
2、够以模版为准切掉错配的碱基,因而得到的PCR产物多数是平末端,不能用T载体克隆。通常需用目的载体多克隆位点上的平末端单酶切位点,单酶切得到平末端的线性片断,直接连接PCR产物。这类酶得到的产物通常不能用TA克隆试剂盒。目前也有商业化的平末端PCR产物克隆试剂盒,不过较少用。平末端的连接效率低,通常需要高浓度的连接酶,较长的连接时间,合适的片断:载体比例,有的时候还需要调整反应体系的ATP浓度或者增加聚乙二醇(PEG2000),以得到较高的连接效率。许多厂家都有推出快速连接试剂盒,比如NewEnglandBiolabs新出的5分钟快速连接试剂盒,能够简化
3、平端连接步骤和条件,缩短连接时间,提高连接效率。 不过需要注意的是一些厂家(例如Clontech、Gibco/BRL、Roche)也生产一些用于PCR的高保真混合酶,是采用常规Taq酶和一些有校读功能的(proofreading)的聚合酶按比例混合(这样得到的混合酶的保真性比普通Taq酶高一点,但通常不如Pfu、ProofStart等酶),因而得到的PCR产物也是平端和A末端的混合产物,是否能用TA克隆试剂盒需要参考厂家的说明。 方法2是比较常用的经济的方法,不需要购买T载体,可以直接通过酶切PCR产物,得到粘末端,直接连接到目的载体上。在顺的
4、时候,这种方法是非常简单的。可有时候也会出问题,双酶切就是连不上,比较常见的原因是PCR产物双酶切不完全,比如没有纯化产物就直接双酶切,有的酶比较“娇气”容易出现“切不动”或者是“星号活力”,得不到正常的粘末端而连不上。有时是因为选定的两种酶反应条件相差比较大,为了省事同时双酶切(通用Buffer不是一定通用的,不能过分迷信,有时会成为莫名其妙出错的根源),也会出现类似的错误。还有一种情况是由于有些酶在酶切时需要一定的“占位空间”,也就是要求酶切识别序列的前后有一定数量的碱基才能正常酶切,而设计引物时酶切位点直接就在5'末端,没有留下足够的保护碱基而导
5、致PCR产物酶切不动,无法正常的克隆。由于这些错误很难检查,有的时候会浪费大量的时间,还是莫名其妙没有结果。 由于常见的Taq酶或者没有校读功能的DNA聚合酶(即不是高保真)在PCR扩增的时候通常会在PCR产物末端多添加一个A(即增加一个模版上不存在的A)。这个突出的A成为PCR产物TA克隆技术的基础。带有互补的突出T末端的线性载体能够有效提高PCR产物的克隆效率,解决方法2遇到的难题,所以方法1也是目前比较常见的方法。 TA克隆在顺的时候也很简单,简直就是“apieceofcake”,不用考虑酶切位点,引物设计等等问题,好的载体克隆效率高、重
6、组率高而且两端有丰富的单酶切位点便于后继的克隆,但是烦的时候也会出现无缘无故克隆不上或者重组率很低的问题。比较容易忽略的问题是用高保真的酶进行PCR扩增,应该选用平端克隆载体而错用了TA载体。常见但很难解决的问题则是由于T末端容易和其他碱基错配而导致自身环化或者克隆了引物/自身褪火引物二聚体或者PCR不完整产物,因而出现假阳性。因而QIAGEN公司推出了UA克隆试剂盒,用突出的U末端代替T末端,由于U碱基能够有效减低和其他碱基(T、C、G)非特异退火的几率,因而能有效提高PCR产物的克隆效率。 但是,是否还有其他因素会影响PCR产物的克隆效率呢?最
7、近,QIAGEN公司的研发专家发现,PCR引物5'端的碱基(也就是引物第一个碱基)的不同,会影响PCR产物的克隆效率!以后设计引物可要注意了!看看QIAGEN的专家怎么说——RalfPeist,DorotheeHosel,TheaTutjes,andDirkLoffert 基于UA的克隆技术广泛应用于PCR产物的快速、简便和高效的克隆。由TaqDNA聚合酶为PCR产物添加的多出来的一个A碱基能够和pDriveCloningVector(QIAGENPCRCLoningKit提供)载体上的互补的U碱基配对结合。PCR产物能够高效地结合到载体上,无需在
8、引物中引入限制性内切酶位点,无需酶切或者平端连接。 在某些特殊情况下,由于一些未知的原因,
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