PCR实验室7500SOP

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1、分子生物操作手册版本号：B修订号：0文件标题：ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序发布日期：文件编号：LAB-SOP-FZSW-011生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第1页，共4页【】ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-0111.目的：确保ABI7500仪器的正确使用及正常运行2.适用范围：美国应用生物系统公司生产的ABI7500实时荧光定量PCR仪3.运行环境：电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。通风：仪器的通风应该没有阻挡。温度：推荐实验室配备空调，温度应

2、该控制在10～30℃之间。湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。4.操作程序：4.1开关机程序：开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭ABI7500系统软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。4.2创建绝对定量反应板文件：4.2.1依次选择Start>Programs>AppliedBiosystems7500>AppliedBiosystems7500SDSSoftware()，

3、以启动SDS软件;或在桌面双击AppliedBiosystems7500SDSSoftware()图标。4.2.2选择File（文件）>New（新建）。4.2.3在NewDocumentWizard（新建文件向导）窗口中，从Assay（实验）下拉列表中选择AbsoluteQuantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线）。接受Container（反应板类型）和Template（模板）字段中的默认设置（即分别为96-WellClear（空白96孔板）和BlankDocument（空白反应板））。4.2.4在DefaultPlat

4、eName（默认反应板名）字段中输入反应板文件名，或接受默认文件名。4.2.5单击Next>（下一步>）。4.2.6选择要添加到反应板文件的探针。A）单击以选择一个探针。（按住Ctrl键单击可选择多个探针。）如果在DetectorManager（探针管理器）列表中未列出探针，请创建探针。B）单击Add>>（添加>>）。探针即被添加到反应板文件。C）单击Next>（下一步>）。4.2.7为每个反应孔指定探针和任务。A）单击一个反应孔（或对于重复选择一组反应孔）以选取它（们）。B）单击探针名，为反应孔选定探针。C）单击Task（任务）栏的下边，以指定探针任务。

5、D）为包含标准样本的反应孔输入量值。E）单击Use（使用）。所选反应孔中显示探针任务和颜色。F）单击Finish（完成）。SDS软件即创建反应板文件。分子生物操作手册版本号：B修订号：0文件标题：ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序发布日期：文件编号：LAB-SOP-FZSW-011生效日期：编写人：审核人：发布部门：中心主任：批准人：其他：页码：第2页，共4页4.2.8输入样本名。A）单击或选择View（视图）>WellInspector（反应孔设定）。B）单击一个反应孔或拖动鼠标选取多个重复反应孔。C）输入样本名。D）如果必要，更改P

6、assiveReference（阳性参比荧光）设置。（默认情况下，选择ROX™荧光。）E）重复步骤b至d，直到您为反应板上的所有反应孔均指定好样本名和阳性参比荧光。4.2.9在Setup（设定）选项卡上，检查并核对每个反应孔的信息。4.3设置热循环条件并开始运行反应板4.3.1选择Instrument（仪器）选项卡。默认情况下，显示两步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法中PCR步骤的标准PCR条件。4.3.2验证以下各项：A）如果您使用两步法RT-PCR–则已设置默认的PCR热循环条件。B）如果您使用“中山大学达安基因股份有限公司”的试剂–请按以下

7、循环条件设置：93℃2分钟→1个循环；93℃45秒→55℃60秒→40个循环。C）SampleVolume（样本体积）为50µL。D）9600Emulation选项选取。4.3.3选择File（文件）>SaveAs（另存为），为绝对定量反应板文件输入一个文件名，然后单击Save（保存）。4.3.4将反应板装入仪器中。4.3.5单击Start（开始）。在仪器运行PCR程序期间，Instrument（仪器）选项卡上会显示实时状态信息，并报告荧光信号强度。程序运行结束后，状态值和按钮变为灰色，而且Analysis（分析）按钮()变为可用状态，并显示信息提示您程序

8、是否成功运行。程序运行期间生成的所有数据都保存到步骤4.3.3中指