的分离、培养和人工重建

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1、第三章地衣共生菌藻的分离、培养和人工重建地衣是否能分为单个生物不同有机组织的相互关系更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题次生代谢物的研究一、共生真菌的分离和培养1、地衣型真菌常用的培养基2、子囊孢子释放法3、组织培养法4、培养共生菌的保存1、地衣型真菌常用的培养基WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基琼脂4g蒸馏水补足100mlMY培养基——麦芽酵母提取物培养基麦芽提取物20g/酵母提取物2g/琼脂20g/蒸馏水补足1000mlLB培养基——LillyandBarnett’s培养基葡萄糖10g/天冬酰胺酸2g/KH2PO41g/MgSO4•7H2O0.5g/Fe

2、(NO3)3•9H2O0.2mg/ZnSO4•7H2O0.2mg/MnSO4•4H2O0.1mg/维生素B10.1mg/维生素H5ug/蒸馏水补足100ml可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足1000ml，并制成固体培养基。LBG培养基——Lillyandbarnettgelrite培养基LB培养基中以1%的Gelrite代替琼脂。注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前应将所有培养基进行灭菌。2、子囊孢子释放法3、组织培养法4、培养共生菌的保存共生菌可以存放很长时间（大约一年左右）。通常共生菌在15~20℃时表现出最大生长率。每种均有其最适生长PH值，通

3、常PH范围为5~6。太高或太低的PH均会阻碍其生长。在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。二、共生藻及蓝细菌的分离和培养1、培养基2、培养前处理3、共生藻的培养4、无菌培养群体的分离5、共生藻培养的保存1、培养基BBM培养基——Bold’sBasalMedium3×NBBM培养基Trebouxia培养基MDM培养基2、培养前处理1）清洗对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约1㎝2，然后放在自来水中浸泡5~10分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入

4、装有1~2ml的无菌水和一滴Tween－20的小试管中。超声波粉碎约3分钟。离心去除地衣体表面的附属物。2）地衣体匀浆液的制备大型地衣（枝状或叶状）：（1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。（2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。（3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。（4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。较小地衣体：清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理

5、，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。3、共生藻的培养含共生藻的悬浊液15天培养：15～20℃共生藻群（1个月左右）要注意藻的污染4、无菌培养群体的分离直接挑选法：体视显微镜喷雾法微量吸管吸法离心法利用喷射法对共生藻进行分离的方法利用微量锡罐分离单个细胞的共生藻5、共生藻培养的保存在低光照的条件下，可以培养很长一段时间（约1年）。最好每2~3个月传代一次。大多数的地衣共生藻的最佳生长温度为15~20℃。其生长的最佳pH范围是

6、4~7。（1）用解剖刀将带有琼脂培养基的共生藻群体分为几部分（约５mm2），将群体放在有合适培养基的皮氏培养皿中培养2-3个月.（2）每2-3个月将生长的群体转移到相同成分的新鲜培养基上，在相同的条件下培养。地衣共生藻也可以在液氮下冷冻保藏相当长的时间仍保持活性。三、地衣菌、藻共生的人工重建Stocker-Wörgötter（1994）地衣体人工重建的基本操作步骤如下：（1）收集你想重建的地衣（如Peltigeraaphthosa）基物处的土壤。（2）用筛孔约1~2mm的筛子将500g土壤过筛，然后在其中加入100ml的二次蒸馏水。（3）将湿的土壤放入100×15mm的玻璃皮氏皿中，

7、填充高度为8mm。对其进行高压灭菌后放置24小时，然后再次高压灭菌。（4）用无菌培养的共生绿藻和蓝细菌对土壤进行接种，然后在以上所描述的培养条件下对其进行培养。（5）准备好用于人工重建的分离的共生真菌，并将其转移到无糖的液体培养基上（如BBM），然后培养约1个月。（6）将匀浆所得的菌丝体覆盖到绿藻或蓝细菌群体上。（7）将重建群体在培养室中培养，培养室条件应同他们共生藻的生长条件一致。思考题：1．地衣共生菌分离方法有哪些？并简述孢子释放法步骤。2．共生藻的分