细菌的分离接种和培养

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1、实验五细菌的分离、接种和培养目的要求实验原理实验材料实验步骤操作规范示例作业一、目的要求掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离和纯化微生物的方法和原理；倒平板；细菌纯种分离：稀释混合平板分离法、稀释涂布平板分离法和平板划线法；接种技术；无菌操作技术；在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得纯种的微

2、生物，一般根据该微生物营养或培养特点(微生物对营养、酸碱度、氧等条件)，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。二、实验原理三、实验试剂与器材土壤样品（环境样品）牛肉膏蛋白胨培养基；无菌试管、无菌三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿；超净工作台（一）稀释混合平板法四、实验步骤1.土壤稀释液的制备①称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中

3、，振荡15～20分钟，使微生物细胞分散，静置约20～30秒，即成10-1的土壤悬液。②另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，用无菌吸管吸取10-1土壤悬液lml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。再用另一支吸管吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml，加入编号10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成10-3的土壤稀释液，一定要每次更换一支无菌吸管（连续稀释）。同法依次分别稀释成10-4、10-5和10

4、-6等一系列稀释度菌悬液。2.平板制作将无菌培养皿编上10-3、10-4、10-5号码，每一号码设三个重复，用1ml无菌吸管按无菌操作要求吸10-5稀释液各1ml，分别放入编号10-5的三个培养皿中。同法吸取10-5稀释液各1ml，分别放入编号10-4的三个培养皿中。再吸取10-3稀释液各1ml，分别放入编号10-3的三个培w1养皿中。然后在9个培养皿中分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整个操

5、作过程应严格按照无菌操作。3.培养与移植待平板完全冷凝后，将平板倒置37℃恒温箱中培养24～48小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置于37℃恒温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养。（二）稀释涂布平板法此法与稀释混合平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先将牛肉膏蛋白胨培养基融化，在火焰旁注入培养皿，摇匀后制成平板，然后用三支1ml无

6、菌吸管分别由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于37℃温箱中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。（三）平板划线分离法制备土壤稀释液倾注平板培养挑菌落接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀移接斜面常用的接种方法划线接种点接种穿刺接种涂布接种液体接种注射接种斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5

7、)接种(6)塞好棉塞纯化（平板划线法）倒平板——划线——培养——挑菌落——纯种（纯培养）平板划线分离的方法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法五、微生物实验技术操作规范示例（一）斜面接种无菌操作技术（二）倒平板及平板划线接种（一）斜面接种无菌操作技术(二）倒平板及平板划线接种（三）平板划线接种：六、作业1.简述无菌操作过程中的注意点。2.拟出从土壤中分离细菌的主要实验步骤。3.如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？4.培养时为什么要将培养皿倒置培养？一、视频演示二、取自己做的培养皿，

8、观察，并作图三、挑取菌落，进行革兰氏染色，初步判别革兰氏阴性或阳性菌四、将自己的培养皿、试管清洗干净，放入抽屉五、作业：从土壤中分离细菌的主要实验步骤。