生物化学技术原理及应用(I)

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1、第一编概述生物化学技术原理及应用主讲：孙伟第一章生命大分子物质的制备第一节材料的选择与处理第二节确立测定方法第三节细胞的破碎第四节抽提第五节浓缩第六节纯化方案的设计与评价第七节有效成分纯度和性质的分析第八节应用实例生命大分子物质通常是指：动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。生命科学研究将进入后基因组时代。分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(这部分移至后面的章节介绍)等步骤。第一节

2、材料的选择与处理一、材料的选择A.有效成分是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其他物质则统称杂质。B.有效成分在材料中存在的特点有效成分的含量一般较少如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。有效成分稳定性较差大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。选用的材料不同，有效成分的含量就不同；选用的材料即使相同，但是部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。C.材料选择应遵循的原则有效成分含量多、稳定性好来源丰富、保持新鲜提取工艺简单有综合利用价值等二、材料的处理选择到合适的材料后，应及时使用，或采用冰冻或干

3、燥等方法处理。同时还应将易于去掉的非需物质除去。1动物脏器(1)冰冻应在很短时间内置-10℃冰库(可短期保存)或-70℃低温冰箱(数月不变质)贮存。脱脂脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。一般脱脂的方法有：A.人工剥去脏器外的脂肪组织；B.浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂；C.采用快速加热(50℃左右)、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去；D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。(2)干燥A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用；B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。2植物组织A.叶片用水洗净即可

4、使用；或在l0h内置-4～-30℃冰箱贮藏备用。B.植物种子需泡胀或粉碎才可使用。材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。3微生物为制备生命大分子物质的主要材料之一。用离心法收集到的上清液，可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分；可置低温下短时间贮存。收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分；或制成冻干粉，在4℃保存(数月不会变质)。第二节确立测定方法一、目的与要求测定哪些材料含有目标有效成分？哪些材料含量丰富？提纯过程纯度是否逐渐增加？要确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。因为：有效成分在原材料中含量较低；底物要专一性的。二、常用的测定方法1.光

5、谱法2.电化学法3.生物活性检测法4.免疫分析法5.生物传感器1光谱法(1)吸收光谱法[①直接测定法；②比色法](2)荧光法(3)浊度法特点：测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值；且操作简单，反应迅速、灵敏；结果也较准确，(1)吸收光谱法直接测定法、比色法①直接测定法将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。A.测定核酸含量构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值(A260)随之

6、增加或降低，二者之间成正比关系。通常1个A260值分别相当于双链DNA50µg／ml单链DNA37µg／ml单链RNA40µg／ml用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度：纯DNA比值为1.8纯RNA的比值为2.0当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。B.测定蛋白质的含量及纯度蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。②比色法将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产物

7、特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。例如：邻苯二酚(在275nm有吸收峰)+邻苯二酚-2,3-双加氧酶黄色的α-羟基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰)通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活力。还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度例如纯细胞色素c还原型A550／氧化型A280比值为1.25~1.28。假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂质。(2)荧光法特点：荧光法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光法却能求得满意结果。如：NAD(菸酰胺腺嘌呤

8、二核苷酸)（辅酶Ⅰ）NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（辅酶Ⅱ）由于NADH2