造血干细胞表型及分离纯化方法

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1、造血干细胞表型及分离纯化方法一个多世纪前，由Arturappenheim(1870~1916)提出。是一类同时具有自我更新和向各系血细胞分化能力的原始细胞群。HematopoieticStemCell支持干细胞存在的初始证据1.从小鼠独特的染色体标记中证实，存在能同时产生淋巴和髓系细胞的多能干细胞(pluripotent)。2.慢性髓性白血病同工酶分析可见，B淋巴细胞和髓样细胞都来自慢性髓性白血病干细胞克隆。3.用带有新霉素抗性基因标志的逆转录病毒载体转染鼠骨髓细胞，分析病毒特异聚集部位证实，不同淋巴和髓系表型的细胞来自同一干细胞。4.鼠胎肝造血祖细胞体外单细胞培养

2、可生成髓系和粒系细胞。缺乏辨认、计数干细胞的手段。干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估算如：CFU-GM，CFU-Mix。Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗(My-10),当时称KG-la,该抗体可与所有造血前体细胞(progenitors)特异结合。过去干细胞研究进展缓慢的原因之后，其他研究小组也相继研制出12.8;BI-3c5;ICH-3等类似抗体。1986年，这些抗体被命名为CD34，为目前公认的干细胞的重要标志。CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展，是一重要的里程碑事件。一.造血细胞的表型CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；

3、c-kit二.造血细胞分离方法FACS；磁柱分离；亲合分离；Panning本次课的主要内容一、造血干细胞表型免疫技术、克隆技术、流式细胞分类术等的发展，促进了干细胞的研究，相继发现许多干细胞特有的表型(phenotype)。如CD34；Sca-1；Thy-1；Lin；c-kit等。1.CD34的生物学特性（一）CD34基因定位Chromosome1,(1q32)(human)也有报道位于1q12qter与CD45及一些其它膜蛋白家族毗邻。全长(spans)26~28kb(human),编码序列含8个exons，第1和8个exon编码翻译区和部分非翻译区；2~7个ex

4、ons仅编码翻译区。也有报道人CD34基因全长38kb。基因长度在cytoplasmicdomains,人、鼠CD34基因的同源性达90%以上。这种同源性在N末端逐渐减少为45%左右。人、鼠CD34基因的同源性分子量为105-120kd。人CD34cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基，是一跨膜蛋白。CD34分子的大小N端为20aa的信号肽，含有大量的serine/threonine；胞外区258aa；跨膜区22aa；胞内区73aa。不同部位AA的长度为：所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3,TU

5、K,115.2等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于sialicacidresidues,后二者却不一样。CD34分子的epitopes（根据对neuraminidase和glycopotease的敏感性不同）对GPAs敏感，对NAAs敏感性不同(My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3)对GPAs，NAAs都敏感(TUK3,115.2,8G12)对NAAs不敏感，对GPAs敏感(QBEND-10)CD34表位分三类：许多CD分子既是细胞分化的标志也是功能的标志。CD34分子的确切功能目前尚不完全清楚，但已发现具有以下功能：2.CD34的功能(1)粘附功能(

6、与stromalcell粘附)电镜发现CD34分子浓集在内皮交叉膜(interdigitatingmembrane)的micro-processes。此部位是白细胞结合并迁移到血管外的重要部位。CD34分子的结构可能影响其与细胞的粘附。此外，淋巴内皮小静脉粘附实验表明，由重组L-selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列与CD34一致，因此，CD34分子至少可作为L-selectin的配体，协助干细胞与基质细胞接触和粘附。干细胞越原始，表面CD34分子密度越大，细胞分化到形态学发生改变时，表面CD34分子表达逐渐减少，直至消失。推测，在造血

7、早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。(2)细胞间接触、通信和相互作用Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。(3)在细胞信号传导中的作用外周血单核细胞约为0.1%破骨细胞(osteoclasts)、骨髓基质前体细胞、外周神经鞘细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表达。骨髓单核细