细胞培养标准操作程序(SOP)

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1、细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。3．操作规程：3.1  培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。2、将

2、培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。6、配青霉素 80万/瓶 +4ml 蒸

3、馏水       溶解 配链霉素100万/瓶 +4ml 蒸馏水      溶解  取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。    一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯

4、、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗    水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。 3.1.2  PBS（平衡盐溶液）的配制 NaCl 8g KCl 0.2g              ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml Na2HPO4*H2O 1.56g KH2PO4 0.2g （1） 无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）  （2） Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12H2O需3.4888g （3） 如欲配制500

5、ml，以上成分减半即可 3.1.3  0.25%胰蛋白酶的配制   胰蛋白酶粉          2.5g  EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3g  NaCl                    8.0g          KCl                       0.4g                            `     +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML  NaHCO3           0.5g  Glucose(葡萄糖) 1.0g   酚红                     0.06g（1

6、）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可 3.2  细胞复苏1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管

7、架、镊子，右上角放废液缸。2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FB

8、S（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴