第1节DNA重组技术的基本工具

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1、专题1：基因工程基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，故又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。生物体外基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达符合人类需要的基因产物基因拼接技术或DNA重组技术基因工程的产物基因工程产品抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鲑鱼分子手术刀：核酸限制性内切酶（限制酶）分子缝合针：DNA连接酶分子运输车：载体1.1DNA重组技术的

2、基本工具识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。1、主要来源：2、作用：作用特点：作用位点：3、结果：一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）两种末端黏性末端平末端原核生物为什么限制酶主要来源于原核生物？其在原核生物中的作用是什么？特点：反向、对称、重复排列为什么原核生物中的限制酶不剪切自身的DNA分子？专一性/特异性磷酸二酯键限制酶的识别序列：EcoRⅠ黏性末端黏性末端切割的位点：G、A之间断裂的化学键是：磷酸二酯键SmaⅠ平末端　　　平末端产生黏性末端或平末端。限制酶的作用结果：限制酶所识别的序列，无论

3、是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG双链断开不同来源的DNA片

4、段结合1、种类：2、作用部位：大肠杆菌:E·coliDNA连接酶——黏性末端T4噬菌体:T4DNA连接酶——黏性末端和平末端（效率低）磷酸二酯键二、“分子缝合针”—DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶要想使两个不同的DNA分子重组，必须用同一种限制性核酸内切酶切割DNA连接酶与DNA聚合酶比较DNA聚合酶DNA连接酶相同不同作用对象模板形成磷酸二酯键单个脱氧核苷酸DNA片断需要不需要G

5、CTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（二）连接酶的部位：磷酸二酯键，不是氢键GCTTAAAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键重组DNA三、基因的载体——“分子运输车”2、载体必须具备的条件：1）、能够在宿主细胞中稳定保存并复制2）、具有多个限制酶切点，以便外源基因连接；3）、具有某些抗性基因（标记基因），便于重组DNA的鉴定和筛选4）、对受体细胞无害，大小合适1、常用的载体有：质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别天然的DNA分子可以直接用做基

6、因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：27483615GAAB限制酶作用是A处还是B处？A处练习在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作

7、的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达练习1.下列有关基因工程的叙述，正确的是（）A.重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体B.所有限制性核酸内切酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C.一般选用细菌的质粒作为基因进入受体细胞的载体D.细菌体内的质粒可以直接作为基因工程中的载体2.下列关于质粒的叙述，正确的是（）A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.质粒是细菌细胞质中能够自