计数平板菌细胞技术

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1、实验二酵母菌大小的测定和细胞计数一、实验目的1、学会测微尺和血球计数板的使用方法。2、建立对微生物大小的概念。二、实验材料1、显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数板、载玻片等。2、麦芽汁培养基、酵母菌。3、吸管、吸水纸等。三、实验原理(一)酵母菌大小的测定原理所有微生物的大小需要用刻有一定刻度的测微尺来测量，先用绝对长度的物镜测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度，然后放上待测的标本，用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数，就可计算该微生物的大小。酵母菌的直径约8-1

2、0μm。(二)酵母细胞计数原理微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。四、操作方法(一)酵母菌大小测定的操作方法1.测微尺的构造和使用方法(1)目镜测微尺的构造目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确的刻度，通常是将5mm划分为50格，实际每格等于100μm。刻

3、度的大小是随使用的接目镜和接物镜的放大倍数而改变，用前必须用物镜测微尺来标定，如图。(2)物镜测微尺的构造物镜测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm，如图。2.目镜测微尺的标定(1)取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。(2)将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。(3)先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物

4、镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。如图(4)记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。3.计算方式(1)目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10／两个重叠刻度间目镜测微尺格数(2)以同样方法，分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度。目镜测微尺()格=物镜测微尺()格目镜测微尺每格=()(3)如此测定后的目镜测微尺的尺度，仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数。若更换物镜

5、、目镜的放大倍数时，必须再进行校正标定。4.酵母菌大小的测定(1)取下物镜测微尺，换上酵母菌水浸制片。(2)测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。(3)在同一标本上测定5-10个菌体，求其平均值。(二)酵母细胞数的测定操作方法1.血球计数板的构造血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的

6、长和宽各为1m，深度为，其体积为0.1mm3。计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。2.血球计数板的使用(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即可。(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用

7、的厚玻片。(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。(6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞)。(7)对每个样品

8、计数三次，取其平均值，按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。3.计算公式(1)16格×25格的血球计数板计算公式：酵母细胞数／ml=100小格内酵母细胞个数／100×400×104×稀释倍数(2)25格x16格的血球计数板计算公式：酵母细胞数／ml=80小格内酵母细胞个数／80×400×104×稀释倍数4.血球计数板的清洁血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物