蛋白质化学6-理化性质与分离分析

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1、蛋白质的理化性质、测定及分离纯化蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及应用蛋白质分子量大，是一种胶体溶液；具有特定的空间构象，分子量一定分子筛层析；在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)。蛋白质的胶体性质蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100nm范围之内。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围--水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。与低分子物质相

2、比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯的蛋白质--透析(dialysis)。颗粒大小：在1-100nm之间，属胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷相同不通透性：半透膜(semipermeablemembrane)蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。分散相质点小于1nm为真溶液，大于100nm为悬浊液，介于1-100nm为胶

3、体溶液。透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离出来。在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。透析时，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。常用温度：4℃，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。MWCO:molecularweightcut-off疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系

4、数S。s=v/ω2rs是沉降系数(sedimentationcoefficient)，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，蛋白质、核酸、核糖体、病毒等的沉降系数通常为1-200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S（斯维德贝格单位，Svedbergunit），即1S=10-13秒，如血红蛋白的S约为4×10-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。1924年Svedberg（离心法创始人--瑞典蛋白

5、质化学家）对沉降系数的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。蛋白质的两性电离和等电点蛋白质由氨基酸组成，分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链上还有一些解离基团，如Glu、Asp残基中的γ和β-羧基，Lys残基中的ε-氨基，Arg残基的胍基和His的咪唑基。作为带电颗粒，可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷性质。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液pH影响。当处于某一pH时，蛋白质兼性离子(zwitterion)的净电荷为0，此时溶液的pH值为蛋白质的等电点(isoelectricpoint，p

6、I)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。溶液中的蛋白质颗粒pH=pI时，蛋白质分子所带净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动。pH＞pI时，蛋白质分子所带净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动。pH＜pI时，蛋白质分子所带净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动。在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用，所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。蛋白质在等电点时的溶解度最小pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用蛋白质的变性(Denaturation)天然蛋白质的严密结构在某些

7、物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力、激素丧失活性，即蛋白质的变性作用(denaturation)。变性只是蛋白质空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性的本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两大类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。

8、在变性因素的作用下，可导