GBT19167-2003 传染性囊病诊断技术.pdf

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1、ICS65.020.30B41中华人民共和国国家标准GB/T19167-2003传染性囊病诊断技术Diagnostictechniquesforinfectiousbursaldisease2003-06-02发布2003-11-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局.www.bzxzk.com.GB/T19167-2003．告J山～J～NUJ青传染性囊病（IBD）又名鸡传染性法氏囊病、腔上囊炎、甘布罗病，是由双RNA病毒科禽双RNA病毒属的传染性囊病病毒（IBDV）引起的鸡和火鸡的一种急性、高度

2、接触传染性疫病。本标准参考了世界动物卫生组织［WorldOrganizationforAnimalHealth（英）,OfficeInternationaldesEpizooties（法）,OIE］的《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》所推荐的方法。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准由北京市农林科学院畜牧兽医研究所负责起草，由广西兽医研究所协作起草。本标准主要起草人：刘有昌、刘爵、周蛟、姚炜光、张方亮、贺荣莲、吴健

3、敏、兰美益、黄红梅、蒋冬福、韦志锋。.www.bzxzk.com.GB/T19167-2003传染性囊病诊断技术范围本标准规定了传染性囊病病毒的病原分离、抗原的检测和检测特异性抗体的琼脂凝胶免疫扩散试验、病毒血清微量中和试验、酶联免疫吸附试验的技术要求。本标准适用于传染性囊病的诊断与检疫。2病毒的分离及其鉴定2.1材料准备灭菌组织研磨器、离心机、37℃温箱、孵化器、灭菌吸管、橡胶吸头、灭菌小瓶、灭菌6“针头、灭菌注射器、石蜡。2.2病料的采集和处理采集具有病变的新鲜法氏囊，用加有抗生素（(3000IU/mL青

4、霉素和3000pLg/mL链霉素）的胰蛋白酶磷酸缓冲液或生理盐水制成20％的组织匀浆液，在37℃作用30min-60min,l500r/min离心20min，收集上清液。经菌检培养为阴性后作为接种材料。2.3鸡胚接种2.3.1接种将收集的上清液以每只0.2mL的量经绒毛尿囊膜接种9日龄～11日龄无传染性囊病母源抗体鸡胚或SPF鸡胚（无特定病原体鸡胚），接种后用石蜡封住接种孔。370C孵育，每天照蛋检查，弃去24h内死亡的鸡胚。2.3.2鸡胚剖检结果判定2.3.2.1标准IBDV分离物接种后判定：标准的IBDV

5、分离物接种鸡胚后3d^-5d可致鸡胚死亡。死亡鸡胚充血，在羽毛囊、趾关节和大脑有血斑性出血。肝脏多可见坏死，也可见色淡似熟肉样。2.3.2.2IBDV变异株分离物接种后判定：IBDV变异株经绒毛尿囊膜接种鸡胚，一般不致死鸡胚，接种后5d-6d剖检，可见鸡胚大脑和腹部皮下水肿、发育迟缓、呈灰白色或奶油色，肝脏常有胆汁着色或坏死，脾脏通常肿大2倍一3倍，但颜色无明显变化。2.4易感雏鸡接种试验2.4.1接种取2.2述及的病料上清液0.5mL，经点眼、口服感染5只14日龄～21日龄无IBDV母源抗体鸡或SPF鸡。同

6、时设健康对照组。接种3d后将鸡剖杀，检查法氏囊及脾脏。2.4.2剖检接种结果2.4.2.1标准IBDV接种结果：接种后偶见鸡死亡，剖检可见接种鸡法氏囊水肿、色黄，有时可见出血。脾脏有时可见轻度肿大，表面有灰色点状病变。健康鸡则正常。2.4.2.2IBDV变异株接种结果：接种后不出现死亡，3d剖检可见法氏囊萎缩、质度硬，脾脏可见肿大1倍～2倍。健康鸡则正常。2.5IBD病毒的鉴定2.5.1琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验用已知的特异性的鸡传染性囊病标准阳性血清，用分离株的法氏囊匀浆制备待检抗原，同时制备正常法氏

7、囊匀浆作对照抗原，按AGID常规法滴加抗原和血清进行扩散，如在抗原孔和血清孔之间出现白色沉淀线者判分离物为阳性。.www.bzxzk.com.GB/T19167-20032.5.2直接免疫荧光法2.5.2.1材料及方法2.5.2.1.1高免血清采用CJ801株毒制备的高免血清，经AGID测定效价为1128以上，经中和试验测定在2'Z(1，2084）以上。2.5.2.1.2直接荧光抗体的制备采用33％饱和硫酸馁盐析，沉淀免疫球蛋白，经透析并通过SephadexG50柱去铰离子，用紫外分光光度计测定球蛋白浓度在2

8、0mg/mL-25mg/mL左右，以异硫氢酸荧光素(FITC）按I％量采用热标记方法标记，再经透析和SephadexG50柱层析，收集荧光抗体，保存于一20℃冰箱备用。2.5.2.1.3标本的制备及染色取分离株法氏囊制成冰冻切片或用其组织制成压片。待自然干燥，以4℃保存的冷丙酮溶液固定10min,0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液冲洗两次，蒸馏水冲洗一次，风干后用1：8-1，16荧光稀释液为工作