维电泳的蛋白质提取制备

《维电泳的蛋白质提取制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章二维电泳的蛋白质提取与样品制备制备目的完全溶解解离变性还原蛋白选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分样品制备原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿反复冻融已制备好的样品通过超速离心清除所有的杂质加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白第一节细胞裂解方法温和裂解方法剧烈裂解方法用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白沉淀步骤清除影响二维电泳图谱杂质裂解液组分一、温和裂解法组成较简单样品渗透裂解血细胞、组织培养细胞低渗溶

2、液悬浮细胞冻融裂解细菌、组织培养细胞液氮迅速冷冻细胞，随后在37℃融化，反复几次去污剂裂解组织细胞溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物酶裂解法消化细胞壁溶菌酶细菌纤维素酶、果胶酶植物溶细胞酶酵母在等渗溶液中处理细胞二、剧烈裂解法超声裂解法细胞样品通过切应力裂解细胞迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却弗氏压碎器（FrenchPressurecell）含有细胞壁的微生物在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力研磨法固体组织、微生物冻存于液氮中，随后研磨成粉末机械匀浆法固体组织将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液玻璃珠匀浆法细胞悬液、微生物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞

3、壁三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白酶抑制剂鸡尾酒（proteaseinhibitorcocktail）苯甲基磺酰氟(Pheylmethylsulfonylfluoride，PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活AEBSF：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L，AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点EDTA，EGTA：使用浓度为1mmol/L，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml亮抑酶肽（L

4、eupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基多肽酶甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCk），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPC）K：使用浓度为0.1-0.5mmol/L，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）：使用浓度为1-3mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶四、蛋白沉淀步骤1、硫酸铵沉淀（盐析）原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中步骤：蛋白浓度大于1mg/

5、ml，缓冲液浓度大于50mmol/L，并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10~30min，通过离心沉淀蛋白只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等电聚焦硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用2、三氯醋酸（TCA）沉淀原理①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团,使之聚集沉淀2、三氯醋酸（TCA）沉淀原理③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显④电泳图谱显

6、示，BSA、HSA单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA的结合，使SDS与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致2、三氯醋酸（TCA）沉淀有效的沉淀方法：将TCA加到提取液中，终浓度高达10~20%，冰上沉淀30min；组织样可直接用10~20%TCA进行匀浆；最后用丙酮清洗沉淀，以除去TCA蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶3、丙酮沉淀沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出优点：分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤较为容易在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性4、在丙酮中用TCA沉淀两者联合更加

7、有效10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有0.01%β-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT)，至少-20℃沉淀45min仍然存在难再溶现象5、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀杂质含量高的植物样品很有效蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白此法较复杂，并且耗时较多五、清除影响二维电泳图谱的杂质1、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子在IPG胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦透析、旋转透析、凝胶过