卵巢癌早期诊断和筛选

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1、iTRAQ技术对卵巢癌早期筛查/诊断的蛋白质磷酸化修饰的研究卵巢癌的研究现状目前最普遍使用的卵巢癌生物标记物是肿瘤抗原CA125,尽管80%的晚期卵巢癌病人CA125浓度不正常,但是50%～60%的Ⅰ期卵巢癌病人CA125浓度增高。CA125作为标记物的阳性预测值不到10%。因此,需要寻找特异性更强和灵敏度更高的肿瘤分子标记物。蛋白质组学的新进展尽管人类基因组包含了机体的所有遗传信息,但其只是指导蛋白质合成，而构成细胞并发挥各种功能作用则是由蛋白质来完成，蛋白质还是机体多种不同类型细胞之间差异的决定因素。同样,肿瘤细胞和正常细

2、胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其指导合成的蛋白质组的不同来决定的。因此，有必要从蛋白质组水平来揭示肿瘤的发生机制。蛋白质组学可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋白质种类和数量的改变,不仅有助于肿瘤发病机制的阐明,还能筛选和鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原,在肿瘤的早期诊断、治疗和新药研制方面,具有广阔的应用前景。研究背景蛋白质的磷酸化修饰蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一是生物界最普遍也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰。磷酸化的失调会导致很多严重的人类疾病，如癌症。磷酸化蛋白质检测技术用于卵巢癌研

3、究中，有利于寻找卵巢癌诊断和治疗的靶点。目前，磷酸化蛋白质组学在定量研究方面多采用32P代谢标记、荧光染料染色的磷酸化蛋白质定量分析方法、同位素标记技术等。对于图谱创建中许多磷酸化调控蛋白呈低丰度状况,蛋白质鉴定技术敏感性的提高将是克服这一障碍的关键。随着样本制备技术和仪器设备的迅速发展,更好的富集策略和磷酸化定量两大难点将会不断得到克服,蛋白磷酸化位点的鉴定和定位技术也更易开展稳定同位素标记技术在定量准确度和规模化定量分析方面都有很大的应用前景。这种方法既可以研究全蛋白质组的变化,也可以结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术

4、对磷酸化肽段进行定量研究。目前,可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等技术同样可用于磷酸化肽段的研究。研究背景研究背景我们为什么选择iTRAQ技术？iTRAQ技术是一种新的、功能强大的可同时对多种样品进行绝对和相对定量研究的方法，可以标记生物样品中产生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息，可以实现在二级图谱上的定量，具体原理已有详细报道，但目前有关iTRAQ在磷酸化蛋白质定量方面的研究报道还很少。这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。iTRAQ实际上是一种同位素标记试

5、剂包括一个带电荷的报告基团，另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团。主要观点和创新之处目前，国内外对于卵巢癌的早期筛查/诊断尚缺乏有效方法和特异性的肿瘤标志物。我们本次实验意在通过对卵巢癌蛋白质组学研究，或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的差异。基于iTRAQ+蛋白组学研究+蛋白磷酸化修饰的差异基于iTRAQ标记结合质谱技术筛选卵巢癌血清标记物在国内虽有学者研究，但还没有突破性的成果。我们发现国内外尚无学者研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异，我们此次通过研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的磷酸化修

6、饰是否存在差异。从而寻找用于卵巢癌早期诊断的血清肿瘤标志物提供了一定的临床前期研究基础。之所以选择磷酸化修饰作为研究对象，是因为蛋白质磷酸化是最常见，也是最重要的一种蛋白翻译后修饰方式。蛋白质的磷酸化在真核生物的信号转导中具有很重要的作用。基本思路和方法关注新浪微博jdpptor@经典PPT基本思路和方法1、血清来源:选取医院经病理证实为卵巢恶性肿瘤患者晨空腹血清20份，年龄33～70岁，设为卵巢癌组；经体检无任何疾病的健康人群晨空腹血清20份，设为正常对照组。所采集的血清标本保存于-80℃冰箱；基本思路和方法2、血清差异蛋白

7、筛选：1）去除高丰度蛋白：每组样品先取10例冰上解冻。等体积混合得到混合血清。从中取20μL，用缓冲液A各稀释4倍。加入0.22μm的离心过滤器4℃16000g离心1min，去除血清中碎片成分。取稀释血清80μL，进行LC分离，流速0.125mL/min，在11～16min收集低丰度蛋白的流出组分。采用Bradord试剂盒检测馏分蛋白浓度。其余样本-80℃保存待用。2）蛋白定量标记：1.2mL的预冷丙酮加入300μL低丰度蛋白血清，见沉淀物形成。4℃15000g离心100min，弃上清，沉淀室温放置20min使丙酮挥发完全。然

8、后加入20μL溶解缓冲液充分混匀，使样品充分溶解。每组样品取100μg，加入2倍体积的还原剂，充分混合，60℃孵育1h。管内加入半胱氨酸封闭剂涡旋混合后室温孵育10min。按1∶30（胰酶∶蛋白质）的比例向样品管内加入消化酶，涡旋混合，37℃孵育16h。iTRAQ试剂室温冻融