单双波长的使用

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1、单波长和双波长的使用向玉珍概念波长：是在空间或者沿着导线传输的一个波形信号中，相邻周期且同样端点之间的距离。单波长：就是使用一种对显色具有最大吸收的波长即450或492进行比色测定。双波长：除了用对显色具有最大吸收的波长外，同时对特异性显色不敏感的波长如630nm进行测定。问题一问：酶标仪常用波长有那些？答：不同型号的酶标仪安装的滤光片不一样。如：BIO-RAD-550标准波长：405、450、490、655也可选用400~700nmMK3标准波长：405、450、492、630也可选用340~750nm结合工作中实际情

2、况合理的选择酶标仪型号问题二问：为什么试验中的常用波长是450或492nm，少部分是405,而不是其他的波长？答：1.了解市场2.特定波长：在特定条件下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长问题二3.学习两个原理3.1.TMBDAB+联苯醌（在450nm处有最大的消光系数）So:ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450比色测定结果。3.2.pNPPpNP（在4

3、05nm处有最大的消光系数）HRPH2O2AP问题三问：为什么有的波长需要添加一个副波长？而且常用的是630nm？答：1.Madersbacher和Berger做了个实验首先是用450和405测定一系列的已知浓度的标准本品，证实450/405Z之比为3.2;其次用405测定很低浓度的标准品的OD值再乘以常熟3.2，即为待测样本在波长450的值。问题三证明：双波长测定可以提高ELISA的敏感度。2.每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长

4、下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。3.630nm下得到的吸光度是非特异性，主要来时于板块上诸如指纹、灰尘，赃物等所致的吸收。问题四问：双波长测定时OD结果是如何计算得出的？答：样本值=敏感值-非敏感值敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。实验分析1问题五问:单波长测定的干扰因素有那些？答：1.内源性干扰

5、包括噪音、漂移、电压等2.表面张力的影响3.重复性差问题六问:双波长测定的优点？1.一般不必设空白孔。仍设空白孔，就可能会出现负值。2.能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。3.重复性好。实验分析2刮花前刮花前刮花后刮花后总结现象：1.单双的结果差异比较大2.刮花对双波长的影响比较的小讨论：结论：运用双波长不会影响灵敏度，反而会减少其他因素的干扰。建议酶免法测定使用双波长，这样可以提高临界值附近样本结果判断的准确度，减少实验误差。波长选择原理1.首先要确定显色液的

6、最大吸收峰联苯联苯醌：450nm甲苯、二甲苯：465nm硝基酚：405nm2.结合试剂说明书选择波长用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需用空白对照孔调零），并记录结果。Thanksforyourattention!