药用植物基因工程研究

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1、植物基因工程技术研究进展AdvancesinGeneEngineeringofPlants汇报内容植物基因工程的概念主要内容及相关的技术药用植物基因工程研究小结一、植物基因工程的概念所谓植物基因工程，是指利用基因工程的普遍原理和通用技术，将特定目的基因经克隆修饰后，与合适的表达元件和合适的转化载体进行重组，进而转入植物细胞内，使之稳定整合在植物基因组中正常的表达和遗传，最终改良植物的遗传性状或获得有用的基因产品的方法．二、植物基因工程的主要内容及相关的技术分离有用目的基因的方法：PCR扩增技术、基因文库分离

2、法、化学合成法等.mRNA差别显示技术、代表性差式分析（RDA）、和抑制性减法杂交（SSH）等是在PCR基础上建立的分离和克隆目的基因的新方法.DNA插入诱变法也称DNA标签法是从野生型基因组DNA文库中克隆目的基因的方法，主要有两种类型：转座子标签法和T-DNA标签法，此外还有标签测序法，包括表达序列标签法和基因表达序列分析法.植物表达载体的构建，即对目的基因进行一些修饰，改造:5ˊ端加启动子，3ˊ端加终止子。目前最常用的启动子是从花椰菜花叶病毒中分离出来的35S启动子，其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的NOS

3、启动子和OCS启动子。目前最常用的终止子是胭脂碱合成酶的Nos终止子和Rubisco小亚基基因的3ˊ端区域。目的基因转入植物的方法:一种是载体法:土壤农杆菌Ti质粒和Ri质粒介导的遗传转化法。例子，张荫麟等用发根农杆菌和根癌农杆菌感染丹参无菌苗，分别诱导出毛状根和冠瘿瘤，使其在无激素培养基及光照条件下分化出丹参再生植株，以发根农杆菌转化的再生植株具典型毛状根再生植物的特征，根癌农杆菌转化的再生植株株形高大，根系发达，丹参酮含量高于原植物。另一种是直接转移法:目前的技术有电击法、基因枪法、激光微束穿孔法、显微

4、注射法、直接注射法、脂质体介导法、细菌圆球体融和法、多聚物介导法、花粉管通道法、花粉介导法、超声波法、气枪法、涡流法等.转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定1）遗传表型直接筛选：如共转化系统、位点特异性重组系统、转座子系统及MAT载体系统等.其中共转化系统中的双T-DNA载体系统是去除转基因植物中选择标记基因的一种简单有效的方法.2）依赖于重组子结构特征分析筛选3）核酸分子杂交分析为了区分转基因植物与非转基因植物，常借组报告基因，主要的报告基因有：胭脂碱合酶（NOS）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）新霉素磷酸转

5、移酶（NPT1）、荧光素酶（LUC）和β-葡萄糖甘酸酶（GUS）基因，绿色荧光蛋白（GFP）基因等.外源基因表达的检测主要是对特异性mRNA或表达蛋白的检测。一是NPT1和GUS基因融合二是NorthernBlotting和WesternBlotting分析三是主要针对表达蛋白的检测三、药用植物基因工程研究转基因器官的培养发状根培养发状根是植物受发根农杆菌感染后产生的。在感染过程中，发根农杆菌将其Ri质粒的T-DNA上的基因转移并整合入植物基因组，这些基因表达后即产生发状根。特点：①生长速度快；②合成次生代

6、谢产物的能力强；③可以向培养液中分泌一定的产物；④无需添加外源激素Ri质粒转化系统还具有如下优点：①对单个的根尖培养系的研究结果表明，一个发状根是单个转化细胞的克隆体，即使它们含有多个独立的转化发状根，每个发状根的T-DNA结构也是非常稳定的，并且单个根尖的分枝也常具有与亲本根系一样的T-DNA组成。发状根的这种克隆性质有利于筛选和转化机制的研究。②利用Ri质粒转移外源基因容易从发状根或愈伤组织上产生再生植株，不必除去象Ti质粒内的一类致癌基因应用：（1）许多有开发价值的次生代谢产物已从不同植物的发状根培养

7、物中提取出来，有的化合物已通过发状根培养法得以工业化生产或中试生产，其中药用植物较高的有喹啉生物碱、吲哚生物碱等次生代谢产物都是重要的药用化合物。（2）发状根培养生产的次生代谢产物不只限于那些正常植物的根中能够合成的物质，对于那些由植物绿色部分所合成的次生物质而言，绿色发状根更具有十分重要的意义。2.冠瘿瘤和畸状茎培养根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA片段(含tms基因、tm基因)通过根癌农杆菌感染植物，并整合进入植物细胞的基因组，诱导冠瘿瘤组织的发生。特点：冠瘿瘤离体培养时，具有激素自主性、增殖速度较常规细胞

8、培养快等特点，其次生代谢产物合成的稳定性与合成能力较强。植物种类农杆菌/Ti质粒培养物代谢产物石刁柏(AsparagusofficinalisLinn.)C58C1冠瘿瘤颠茄(AtropabelladonnaLinn.)PGV2215(aux)畸状茎天仙子胺到茛胺的生物转化鬼针草(Bidenssp.)Tiplasmid冠瘿瘤多炔类欧洲红豆杉(TaxusbaccataLinn.)B0542、C58冠瘿瘤紫杉醇及其类