苹果酸的制备

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1、苹果酸的酶法制备一、苹果酸的酶法制备（一）苹果酸生产1、苹果酸生产机理L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。2、苹果酸生产用微生物不同的苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、无根根霉、短乳杆霉、膜醭毕赤酵母等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。3、苹果酸发酵工艺L-苹果酸的发酵工艺大体

2、可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。（一）酶法转化工艺酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）

3、。如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体。延胡索酸酶+H2O延胡索酸（反丁烯二酸）苹果酸（2－羟基丁二酸）富马酸酶活力短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。短乳杆菌在等体积的麦芽汁和肉汤加l0g/LCaCO3的培养基，于pH6和37℃培养3天，作为富马酸酶的来源。上述用干细胞作为酶制剂的效果虽然很好，但从实际生产观点出发，如果不需要分离细菌细胞，而将底物直接加入短乳杆菌培养液中将是更为方便和经济适用的。（二）固定化细胞转化工艺富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。但

4、实际上酶的提纯手续复杂，酶的回收率低，成本高。固定细胞法与固定酶法相比，具有下述优点：A、不需要进行酶的抽提和纯化；B、与酶提纯过程相比，细胞固定过程中酶活力的保存率较高；C、酶的光学活性较高；D、成本低但是，固定化细胞的缺点是有副反应存在，特别是易于生成琥珀酸，这在产品中很难与苹果酸分离。幸运的是，细胞固定之后采用一些化学试剂处理可以排除上述副反应。1、产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产产氨短杆菌是用于固定化细胞生产L-苹果酸的最好菌种之一，下面以产氨短杆菌为例介绍固定化细胞生产方法。产氨短杆菌培养基（%）：葡萄糖2富马酸0.5玉米浆1尿素0.2KH2PO40.2MgSO4·7H2O0

5、.05pH7.0细胞在30℃，好氧培养20～24h后，用高速离心机收离菌体，再将细胞悬浮于生理盐水中，再用聚丙烯酰胺凝胶包埋，方法如下：对于16mL悬浮液，加入丙烯酰胺3g，N，N`-甲叉丙烯酰胺0.16g，5%β-二甲基胺丙腈水溶液2mL及1%过硫酸钾水溶液2.0mL，于25℃静置10min。将形成的凝胶切成3mm大小的小块。这种制备好的固定细胞直接使用会有副反应，产生琥珀酸，它在产品中很难与苹果酸分离。工业上，胆汁处理法最为适用。将固定化产氨短杆菌凝胶块装到酶反应柱中进行连续操作的情况下，当lmo1/Ll的富马酸钠溶液（pH7.0）以0.25h-的稀释速率流过反应柱时，在37℃稳

6、定状态下约有80%富马酸转化成了L-苹果酸。固定化细胞反应柱的富马酸酶稳定性与操作温度有关。采用37℃操作温度，反应柱的半衰期约为55天。2、黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产黄色短杆菌等富马酸酶活力较高。上述细菌细胞用卡拉胶固定效果更好。卡拉胶也称角叉菜胶，固定方法如下：8g（湿重）黄色短杆菌细胞悬浮在8mL生理盐水（45℃）中，将1.5g卡拉胶溶在34mL生理盐水中，两者在约50℃混合，冷至约l0℃维持30min。为了增加凝胶强度，再将它浸在250mLl0.3mol/L的KCl溶液中，在10℃维持4h。这样处理以后，用刀将形成的较坚硬凝胶切成3mm大小的小块。为了增加富马酸酶活力和抑

7、制琥珀酸生成，固定后的凝胶块要用含0.3%胆汁和1mol/L富马酸钠的溶液，于37℃下静浸20h。3、酵母细胞固定与苹果酸生产（1）材料活化的酵母细胞、0.05%的CaCl2溶液、海藻酸钠溶液。（2）操作步骤1）海藻酸钠溶液配制取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全融化，用蒸馏水定容至10ml。（注意：加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，知道海藻酸钠溶化为止。）2）海藻酸钠溶液