五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒...

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1、五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒研发背景大部分的大肠杆菌是人或动物倡导的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病。致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发。根据发病机制、临床特征、流行病学特征、O抗原血清及细菌的毒力测定，可将致泻大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌（EPEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、粘附性大肠杆菌（EAEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）。目前针对致泻大肠杆菌的常规实验室检测方法仍然较为薄弱，需要研究快速、简便、准确的分子生物学方法。【检验原理】五种致泻性大肠杆

2、菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，天津生物芯片试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。【使用方法】1.试剂配制（试剂准备区）从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适

3、当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。PCR反应液Taq酶每个反应体系试剂用量23.5μl0.5μl2.PCR扩增（扩增和产物分析区）将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时：Step194℃5minStep294℃30sStep363℃30s30个循环Step472℃90sStep572℃5min3.结果判断（扩

4、增和产物分析区）从PCR管中取出2μlPCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。样品观察到1487bp、910bp、544bp条带即为毒力基因uidA、bfpB和escV阳性，即为典型EPEC菌株。观察到1487bp、544bp、324bp、244bp条带即为毒力基因uidA、escV、stx2A和stx1A阳性，即为典型的EHE

5、C菌株。观察到1487bp、655bp和171bp条带即为毒力基因uidA、elt和estlb阳性，即为典型的ETEC菌株。观察到1487bp和766bp条带即为毒力基因uidA和invE阳性，即为典型的EIEC菌株。观察到1487bp、1111bp、400bp和102bp条带即为毒力基因uidA、pic、aggR和astA阳性，即为典型的EAEC菌株。阴性对照品结果应为阴性。产品特点高效鉴定：通过同步扩增致泻性大肠埃希氏菌典型毒力基因和种属鉴定基因，快速实现对EPEC/EHEC/ETEC/EIEC/EAEC等五种致泻性大肠埃希氏菌的

6、型别划分和鉴定。精确提示毒力基因信息：试剂盒覆盖五种致泻性大肠杆菌全部11种毒力因子，通过对条带大小或荧光信号的判读即可轻松获得待检样品所携带的毒力基因信息。配备设备要求低：该产品对仪器要求不高，普通分子生物学实验室条件即可实现操作。快速简便：该试剂盒操作方法简单，快速：实验全程耗时仅2h左右。产品通过大量菌株测试验证：天津生物芯片拥有庞大的标准菌株库（菌株资源达3500余种）。凭借公司拥有的丰富的菌种资源，对该试剂盒进行了40余种不同来源标准菌株和临床菌株的保守性验证及80余种近缘标准菌株和临床菌株的特异性验证，以确保试剂盒的

7、保守性与特异性。雄厚的研发实力打造高水准质优产品：创新、专业化的研发团队长期从事微生物检测产品开发工作，充分掌握大量关键技术，通过最严谨而科学的实验，打造出一个个高水准质优产品。【注意事项】1.实验前请仔细阅读本说明书。2.本试剂盒不做临床诊断。3.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，试验人员必须进行专业培训，实验过程中严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区用品不能交叉使用。4.样本准备和试剂准备阶段应使用生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用

8、自卸管移液器。5.对每次实验进行质量控制。6.试剂使用前要完全解冻，并混合均匀，但应避免反复冻融。7.样本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。8.实验完毕用10%次氯酸或