基因工程制药的下游技术

《基因工程制药的下游技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第八节基因工程制药的下游技术一、重组工程菌的培养二、基因工程药物的分离纯化三、基因工程药物的质量控制四、基因工程药物制造实例获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装制备基因工程药物的一般程序上游阶段下游阶段一、重组工程菌的培养（一）、基因工程菌的培养方式分批培养(batchculture）补料分批培养(fedbatchculture）连续培养(continuousculture）透析培养(dialysisculture）固定化培养(immobilizedculture）分批培养定义：将种子

2、液和培养基一次性装入反应器内，经过一定时间培养后一次性出料的培养过程。补料分批培养：将种子接人发酵罐中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法连续培养定义：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。两阶段连续培养透析培养定义：利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培

3、养的持续时间段都对产物的产率有影响固定化培养基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利（二）、基因工程菌的培养工艺生物工程菌为含有带外源基因的重组载体的微生物细胞生物工程菌的发酵生产的目的是希望能获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染发酵水平的好坏还直接影响产品的纯化及其质量2.1培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达使用不同的培养基对菌体生长和外源基因表达有较大的影响碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等氮源：酵母粉、蛋白胨

4、、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵及氯化铵等无机盐、微量元素、维生素、生物素等2.2接种量的影响接种量：指移入的种子液体积和培养液体积的比例，它的大小影响发酵的产量和发酵周期接种量小，菌体延迟期较长，不利于外源基因的表达。采用大接种量，可以缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会；但接种量过高往往会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子合成等水平上温度影响蛋白质的活性和包含体的形成2.3温度的影响溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代

5、谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。菌群在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给很重要采用调整搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量（发酵前期采用较低转速，培养后期采用高搅拌转速）2.4溶解氧的影响在发酵过程中pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件决定采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的最佳生长条件（最佳pH范围为6.8-7.4），培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达条件（最佳pH为6.0-6.5）2.5pH的影响诱导时机的影响：一般在对数生长期或对数生长后期诱导表达诱

6、导表达程序的影响2.6其他影响二、基因工程药物的分离纯化基因工程药物的特点目的产物在初始物料中含量低含目的产物的初始物料组成复杂目的产物的稳定性差种类繁多应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源等（一）、建立工艺需了解各种因素含目的产物的初始物料的特点物料中杂质种类和性质目的产物特性产品质量要求（二）、分离纯化的基本过程细胞破碎固液分离浓缩与初步纯化高度纯化直至得到纯品成品加工（三）、细胞的破碎方法物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法生物破碎法：酶溶法（四）、固液分离离心沉淀：高

7、速离心和超速离心膜过滤：微滤、超滤和反渗透双水相萃取（五）、重组蛋白质的分离纯化分离纯化主要依赖色谱分离方法。分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱等色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应离子交换层析离子交换层析(ionexchangechromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法离子交换色谱分辨率高、

8、容量大、操作容易，为多肽、蛋白质、核酸和许多发酵产物分离纯化的一种重要方法阳离子交换剂和阴离子交换剂疏水层析疏水层析(hy