基因工程与基因组学

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1、第13章基因工程与基因组学概述第一节基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相关技术四、基因工程的发展应用一、基因工程概述遗传工程（geneticengineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。基因工程（geneengineering）：利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。二、基因工

2、程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反转录酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease），也称限制性酶(restrictionenzyme),能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。EcoRⅠ属名种名菌株名序号（一）限制性核酸内切酶常见内切酶（二）DNA连接酶连接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二酯键，封闭DNA

3、双链上的缺刻。如：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞(hostcell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。经改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）、酵母菌人工染色体（YAC）和人类人工染色体（HAC）λ噬菌体载体YAC（1Mb）载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA片段。③载体上的限制酶酶切

4、位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。④具有一个选择标记基因。获得外源DNA片段（分）限制性内切酶切割外源DNA片段与载体（切）外源DNA片段与载体连接（接）重组DNA分子转入宿主细胞（转）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析三、基因工程的流程及相关技术（一）外源DNA片段的分离方法构建基因组文库分离法差别显示反转录PCR利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因1.构建基因组文库分离法用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库

5、。供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段分别连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息。保存、筛选差别显示分析基本流程2.差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因（1）套式PCR（2）反向PCR（3）不对称PCR（4）锚定PCR（5）长程PCR（6）反转录PCR4、人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。通过用相同的限制性核酸内切酶切割，连接形成一个重组DNA分子（二）、外源DNA片段

6、与载体的切割和连接（三）、重组DNA转入宿主细胞1.重组DNA转入原核细胞热激转化法电穿孔转化法2.重组DNA转入真核细胞农杆菌转化法重组DNA感受态细胞冰浴混合、静置42ºC热激加入培养基扩培转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热激转化法感受态细胞电转仪调为2.5kV25F脉冲控制器200-400质粒DNA混合加入培养液37℃中速震荡涂板（2）电穿孔转化法2.重组DNA转入植物细胞农杆菌介导的Ti质粒载体转化法（四）重组子的筛选与鉴定核酸杂交PCR检测测序生物学活性检测1.插入抗性失活2.蓝白斑筛选1.抗性插入失活筛选法蓝白斑筛选重组质

7、粒无插入片段的载体和受体菌α-互补产生LacZ，IPTG诱导下，生色底物X-Gal产生蓝色菌落；当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致不能α-互补，使带有重组质粒的细菌形成白色菌落。四、基因工程的发展应用1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段2、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产上应用3、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物4、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递提供了可能。转基因动植物--“生物工厂”5、疾病诊断与基因治疗6、环境保护4.利用基因工程改良动物推荐几本参考书：1、《基因工程原理与方法》，孙树汉编，人民军医出版社2、《

8、基因工程原理》，吴乃虎编，科学出版社（侧重原理）3、《现代基因工程技术导论》，陈