碱性磷酸酶的分离提取

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1、实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定目的要求：1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法1.原理碱性磷酸酶(AlkalinephosphataseEC3.1.3.1简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：取用新鲜的材料，提取工作应在获得

2、材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/LMg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405nm值的增

3、加计算酶活力的大小。酶活力定义为：在37℃下，以2mmol/LpNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1mol/LpNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-Phenolreagent）显色法2操作方法2.1牡蛎碱性磷酸酶的分离提取每组称取20g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50mL预先冷却的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），（两组一起）于高速组织捣粹机匀浆1min，于

4、冰箱4℃放置1h进行抽提。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，（两组分开）并量体积。（留2mL上清液，待测酶的比活力。）在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置0.5h。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。（留2mL上清液，对0.01mol/LTris-HCl缓冲液pH7.5含0.1mol/LNaCl透析平衡，待测酶的比活力。（不做））(5)0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。

5、缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2h。(6)室温离心，4000r/m20min，收集沉淀物。(7)得到沉淀物，溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5。装入透析袋，对0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。(8)取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃25000r/m30min）。(9)离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4℃冰箱保存。20g牡蛎加入50mL预先冷却的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5，

6、含0.1mol/LNaCl），于高速组织捣粹机匀浆1min，于冰箱4℃放置1h进行抽提。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。匀浆液上清液缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1h。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2h。室温离心，4000r/m20min，收集沉淀物。0.35饱和硫酸铵上清液沉淀溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.

7、01mol/LTris-HClpH7.5。装入透析袋，对0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止粗酶液2.2比活力测定2.2.1对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）：取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。管号01234567pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.350.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0

8、mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLO