碱性磷酸酶的分离纯化-袁野

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1、碱性磷酸酶(AKP)的分离纯化生物化学与分子生物学系袁野实验目的:从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。实验原理：采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱性磷酸酶。AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。有机溶剂沉淀概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现

2、象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。常用的有机溶剂沉析剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小:60%乙醇的介电常数是48丙酮的介电常数是22容易获取有机溶剂沉析的特点分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；影响有机溶剂沉析的主要因素温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免

3、目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI）离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L样品浓度:0.5~2%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+1.称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01M的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,进行匀浆。转入离心管，并加2ml0.01M的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌2min，室温放置30mi

4、n，纱布过滤，置于离心管。滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min5min。弃上清，沉淀用4ml0.5MMg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。4.(1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min5min，转移上清于另一离心管。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min5min，弃上清，沉淀用4ml0.01MMg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。5.(1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2

5、000r/min5min，转移上清于离心管，弃沉淀。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min5min，弃上清，沉淀用3ml0.5MMg(AC)2溶解,记录体积c。取0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。6.（1）其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min离心5min，取上清（弃沉淀）（2）上清中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上清（3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作为D液用于

6、比活性测定。用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将A液稀释25倍、B液稀释10倍、C液稀释5倍，D液不稀释。用于含量测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将A液稀释50倍、B液稀释20倍、C液稀释5倍，D液不稀释。(二)碱性磷酸酶的活性测定实验原理：AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为8.8~10,需要镁离子作为激活剂。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的生成量来确定。磷酸苯二钠磷酸盐+酚AKP酚+4-氨基

7、安替比林红色醌类衍生物铁氰化钾管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1酚标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1复合底物3.03.03.03.03.03.01.取试管6支编号（体积单位为ml）2.加入底物后,立即混匀,37℃准确15min后加入0.5%铁氰化钾2.0ml终止反应,混匀,静置15min,510nm比色（大比色杯）AKP纯化程度鉴定AKP纯化程度用酶的比活性反映。酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。BCA法测定AKP蛋白浓度BCA(bicinchoninic